Nosso procedimento cirúrgico permite a edição específica de genes de células leptomeningeais para estudar sua função em muitas condições fisiológicas e patológicas, como o neurodesenvolvimento e a disseminação de meningite bacteriana. Para minimizar os danos durante a entrega intracisternal do endoxifen, utilizamos uma agulha dobrada que pode ser presa contra a borda caudal do crânio para evitar que penetrá-lo penetrasse mais fundo no tecido. O procedimento pode ser usado para sondar o papel dos genes que expressam células leptomeningeais através da perda e ganho de experimentos de função.
Também pode ser adotado para rastrear o fluxo de fluidos cefalorraquidianos. A demonstração visual deste método garantirá a identificação bem sucedida do local de injeção para injeção intracisternal e a compreensão sobre como fixar a agulha contra o osso occipital. Comece preparando uma seringa Hamilton com uma agulha chanfrada calibre 30 para injeção.
Use fórceps para dobrar a agulha a 30 graus três milímetros da ponta. Em seguida, diluir o endoxifen em 10% DMSO a uma concentração de um miligrama por mililitro e enchir a seringa. Anestesiar o animal na câmara isoflurane.
Em seguida, ajuste o suporte da cabeça do mouse para que o bocal esteja aproximadamente em um ângulo de 30 graus da superfície da mesa cirúrgica e fixe a cabeça do animal no suporte. Para melhorar a acessibilidade à cisterna magna, posicione o corpo do animal a aproximadamente 30 graus da superfície da mesa com a cabeça inclinada para baixo, o que estabelecerá um ângulo de 120 graus com o resto do corpo e estenderá a parte de trás do pescoço para facilitar o acesso à cisterna magna. Uma vez que o animal esteja devidamente posicionado, aplique pomada oftalmica, raspe a parte de trás do pescoço e higienize a área com lenços umedecidos e Betadine.
Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão midline começando ao nível do osso occipital e estendendo-se posteriormente. Separe suavemente o tecido conjuntivo superficial e os músculos do pescoço puxando para os lados da linha média com pinças finas de ponta que exporão a membrana dural sobre a cisterna magna. Posicione um pequeno separador cirúrgico para permitir a visualização da cisterna magna durante todo o procedimento.
Identifique a extremidade caudal do osso occipital e insira a agulha anteriormente dobrada imediatamente por baixo. Uma vez perfurada a dura, permita que a ponta dobrada da agulha penetre sob a superfície puxando suavemente a seringa para cima e paralelamente ao corpo do animal, o que garantirá melhor estabilidade. Injete o composto lentamente para evitar interferências no fluxo natural do fluido cefalorraquidiano.
Após a injeção, deixe a agulha descansar por dentro por um minuto e, em seguida, remova-a cuidadosamente com a ajuda de fórceps finos. Feche a pele com algumas gotas de adesivo de cianoacrilato e aplique anestésico local no local da injeção. Retire o animal do suporte e coloque-o em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento.
Em seguida, certifique-se de monitorar o animal até que ele recupere a consciência. Injeção intracisternal de endoxifen em camundongos transgênicos expressando CreER sob o promotor Cx30, um repórter fluorescente indutível permite uma recombinação específica de células leptomeningeais sem rotular o vizinho Cx30 expressando astrócitos superficiais e astrócitos parenchímicos no córtex. Este protocolo de injeção aproveita o movimento fisiológico do fluido cefalorraquidiano para que a solução de endoxifen seja distribuída por todo o espaço subaracnóide para recombinar eficientemente as células leptomeningeais que sobrepõem as lâmpadas olfativas, córtex e cerebelo.
A solução não atravessa a barreira meningeal cerebral ou entra em contato com células astrogliais do parenchyma em oposição à administração sistêmica através de gavage oral. A recombinação das células leptomeningeais após a injeção intracisternal foi identificada através da reatividade Pdgfr-alfa, enquanto os astrócitos superficiais e parenchímicos que expressavam Gfap permaneceram sem rótulo. Ao tentar este experimento, é importante localizar o local de injeção para entrega intracisternal.
Esta demonstração visual fornece o know-how técnico para realizar o procedimento, minimizando o risco de danificar o tecido neural sob ele. Estudos de ablação genética podem ser realizados com essa técnica para investigar o papel das células leptomeningeais na corticogênese e regulação da formação de fluidos cefalorraquidianos e identificar locais adicionais para disseminação de bactérias no espaço subaracnóide.
