Este protocolo bem definido analisa a migração da crista neural primária em mamíferos. Usamos migração de crista neural primária para estudar defeitos congênitos que afetam a crista neural. Esta abordagem nos permite dar uma olhada mais de perto nas células da crista neural à medida que emergem da placa neural.
Testes para comportamentos celulares em tecidos portadores de fascínios de genes mutantes ou após tratamento farmacêutico, permite a triagem de saúde para os efeitos do tratamento medicamentoso ou mudanças ambientais durante o desenvolvimento embrionário. Uma abordagem semelhante pode ser usada para estudar células da crista neural que migram para o coração ou para o intestino ou para estudar células tumorais metastáticas. Adivinhar a anatomia do direito do embrião é um desafio.
Seus tecidos mudam muito rapidamente durante o desenvolvimento precoce. Sugerimos praticar microdisseção antes de realizar um grande experimento. Como os embriões estão vivos e tridimensionais, velocidade e precisão são cruciais.
No dia embrionário 8.5, use ferramentas e soluções estéreis para colher o útero em um recipiente de PBS gelado. Corte o mesometrium para separar cada embrião. Dissecar o útero cuidadosamente, separando cada inchaço decisivo.
A colheita do embrião no estágio de desenvolvimento certo é fundamental para reduzir a variabilidade e aumentar o sucesso na adesão da explanta à matriz, bem como à migração celular. Deslize fórceps entre a camada muscular e o tecido decidual do embrião e use um segundo par de fórceps para remover a camada muscular. Use os fórceps para perfurar a decidua nas bordas da tração mesometrial e use o segundo par de fórceps para rasgar o tecido perpendicularmente ao puxão.
Retire o tecido decidual com as fórceps para visualizar a membrana ricarts antes de remover cuidadosamente a membrana. O sak da gema visceral se tornará visível e o embrião será observado dentro. Remova o sak de gema visceral e o ânion, e posicione o embrião para permitir a visualização da dobra da cabeça.
Corte a dobra da cabeça acima do coração e raspe o mesoderme subjacente para obter uma placa neural limpa. As bordas das placas neurais devem então ser dissecadas. Usando uma pipeta pasteur de vidro, transfira a placa neural dissecada para um prato revestido de hidrogel cheio de crista neural condicional média e gire suavemente o prato para posicionar a placa neural no meio do poço.
Em seguida, incubar a placa neural a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para o período experimental adequado. Às 24 horas após a explanagem, coloque o prato de cultura tecidual no porta-espécimes de um microscópio de contraste facial, e tape a tampa da placa e a agulha de dióxido de carbono para evitar tremer durante a aquisição de vários poços. Em seguida, concentre-se nas células da crista neural craniana a uma ampliação de 10 vezes com um anel de fase correspondente no condensador selecionado.
Para quantificar a capacidade migratória da célula da crista neural, defina o microscópio para adquirir um quadro a cada cinco minutos a uma ampliação de 10 vezes. Para quantificar a morfologia celular, defina o microscópio para adquirir um quadro por minuto a uma ampliação de 40 vezes. Para quantificar a dinâmica da lamellipodia, defina o microscópio para adquirir um quadro a cada 10 segundos durante 10 minutos em uma ampliação de 40 vezes.
Para imagens multi-bem, defina o estágio mecânico para se mover entre as posições de interesse selecionadas de X, Y e confirme que as células da crista neural craniana estão em foco e que as posições do palco estão corretas. Em seguida, clique em adquirir para iniciar a imagem de lapso de tempo. Para rastreamento de células únicas, abra a imagem J e importe os dados como arquivos de pilha de tiff.
Alterar os níveis de orientação e brilho e contraste e clicar em analisar e definir escala para calibrar os arquivos ponto stk em micrômetros de pixel de acordo com as configurações do microscópio. Clique em plug-ins, rastreamento e rastreamento manual para abrir o plugin de rastreamento manual de células J da imagem e selecione adicionar faixa para iniciar o rastreamento de células. Em seguida, rastreie as células através de todos os quadros de filmes de lapso de tempo usando o núcleo como ponto de referência.
Para avaliar a capacidade migratória da crista neural, abra um programa de software de análise de migração adequado e clique na guia de dados de importação para importar os dados de rastreamento celular como um arquivo ponto txt. Em conjuntos de dados e inicialização, selecione o número de fatias ou quadros a serem analisados e defina a calibração x Y e o intervalo de tempo entre os quadros. Selecione aplicar configurações para salvar as configurações.
Em seguida, selecione o símbolo de dados do plot para formar plots de trajetória e selecione o símbolo estatístico para quantificar as medidas de distância e velocidade. Para quantificar a área e a circularidade da célula da crista neural, abra a imagem J e em análise e definir medidas, clique para selecionar os parâmetros de forma celular, área celular, perímetro e descritor de forma. Use a ferramenta de seleção manual livre para desenhar manualmente um contorno em torno de cada célula usando os limites da membrana celular como guia.
Pressione as teclas Control+B no teclado para manter a sobreposição do contorno da célula na imagem e repita para cada célula sobre cada quadro de lapso de tempo. Clique na sobreposição de imagens e para alcançar o gerente de interesse e selecione as células de interesse. Em seguida, clique em medir para obter os valores para os parâmetros de forma celular selecionados de interesse.
Dentro de 24 horas de explanta e cultura, uma região da crista neural craniana epitelial pré-migratória pode ser claramente observada ao redor da explanta da placa neural. Além disso, uma subpopulação de células de crista neural terá sido submetida a transição epitelial para a transição mesenquimal e parecer totalmente mesenquimal. Culturas explantadas em um hidrogel ou fibronectina extracelular, formam estruturas de explantagem semelhantes compostas de crista neural prégratória de placa neural e populações de células de crista neural migratória.
No entanto, explantas banhadas em fibronectina produzem células com lamellipodia mais proeminente na borda principal da célula aparentemente mais polarizada na direção da migração. A microscopia de lapso de tempo permite o rastreamento de coordenadas X, Y de células individuais e a análise da migração de células de crista neural e a análise da dinâmica de morfologia das células da crista neural craniana ao longo do tempo. Delineando membranas celulares individuais, as medidas de área celular e perímetro podem ser calculadas a partir de todos os quadros dos filmes para permitir a quantificação subsequente da área celular e circularidade de indivíduos e grupos de células.
Note que à medida que as células migram para longe da explanta, a área celular aumenta significativamente enquanto a circularidade das células permanece relativamente constante, sugerindo que à medida que as células se afastam da borda epitelial e perdem contatos celulares para células, elas mostram aumento da área de disseminação celular. Preste especial atenção à raspagem do mesoderme subjacente para obter uma placa neural limpa, pois isso promove a migração de células de crista neural para longe do tecido. Muitas outras técnicas como imunostaining, RTPCR ou análise de células únicas podem ser realizadas para analisar diferentes proteínas ou genes de interesse entre diferentes populações de células culturais.
Estamos interessados nos rolos de desenvolvimento de alguns genes-chave do neuroblastoma que podem estar envolvidos na migração de células de crista neural e no uso dessa abordagem para estudar genes de doenças humanas.
