Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas à expressão genética nos mostrando exatamente como a estrutura da cromatina impacta a expressão genética e como a organização da cromatina regula a dinâmica transcricional. Desenvolvemos essa tecnologia porque queríamos ser capazes de alterar controlavelmente a arquitetura cromossômica para permitir a criação de looping de cromatina de longo alcance. Ao mesmo tempo, ter a capacidade de reverter o contexto da cromatina para restaurar a estrutura cromossômica endógena.
Este método foi projetado para facilitar o uso e ampla aplicabilidade. Aproveitamos um dimerizador não tóxico, bem como espécies ortogonais de dcas9, a fim de permitir que o sistema fosse usado de forma mais ampla. Desenvolvemos esse método porque queríamos ser capazes de responder à questão de longa data de frango e ovo sobre se a expressão genética gera arquitetura cromossômica ou se a estrutura do cromossomo leva a mudanças na expressão genética.
O design das sequências de RNA do guia CRISPR e a manutenção das culturas celulares estão descritos no protocolo de texto. Mapas plasmídeos e os primers utilizados estão listados lá dentro. Comece a preparação plasmida misturando cinco microgramas do plasmídeo lentiviral CRISPR com três microlitres de BsmB1 três microliters de fosfatase alcalina seis microlitres de tampão de digestão de 10x e 0,6 microliters de 100 mililitros recém-preparados de DTT.
Leve o volume total para 60 microlitadores de água dupla destilada e incubar a mistura a 37 graus celsius por 30 minutos para digerir e desfosforilar o plasmídeo. Em seguida, o gel purifica o plasmídeo digerido no plasmídeo de loop e água dupla destilada. Em seguida, prepare reações de renas para os pares de RNA guia.
Combine um microliter de cada guia RNA em 100 micromolar com um microliter de 10x T4 tampão de ligadura 6,5 microliters de água dupla destilada e 0,5 microliters de T4 PNK para um volume total de reação de 10 microliters. Para ressar os pares de RNA guia às suas seqüências-alvo incubam as misturas a 37 graus celsius a 30 minutos seguidos de uma incubação a 95 graus celsius por 5 minutos e, em seguida, gradualmente reduzir a temperatura para 25 graus celsius, diminuindo-a em cinco graus celsius por minuto. Em seguida, diluir o guia enlatado RNAs em um a duzentos em água dupla destilada.
Agora, prepare as duas reações de ligadura. Misture um microliter do plasmídeo digerido com 0,5 microlitres de um guia perivaneal diluído RNAse 2,5 microliters de tampão de ligadura 2x um microliter de água dupla destilada e 0,5 microliters de ligase. Incubar as reações à temperatura ambiente por 10 minutos para ligar as guias BsmB1 digerida plasmid.
Em seguida, transforme o plasmídeo recém-ligado em três bactérias estáveis e amplie as bactérias usando qualquer método de preparação plasmídeo. Em uma placa de seis poços, por poço, semente 750, 000 2n3 Tcells em DMEM com 10%FBS e estreptococos de 1%caneta. Use um poço para cada construção e incubar as células por 24 horas.
No dia seguinte, mude o DMEM médio para fresco com 10% de FBS. Logo após a troca do meio para cada poço de células banhadas prepare um tubo de mistura de produção de Lentivírus. Por cada reação, diluir 11 microliters de reagente de transfecção de base lipídica com 150 microliters do meio Opti-MEM para cada reação.
Em seguida, em tubos separados preparar o DNA. Combine dois microgramas do plasmídeo vetorial lentiviral CLOud9 com dois microgramas dos outros componentes de embalagem lentiviral. Diluir esta mistura em 150 microliters do meio Opti-MEM.
Em seguida, misture volumes iguais da mistura plasmida lentiviral diluída no reagente diluído de transfecção à base de lipídios e incubar as misturas por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, a cada poço de células adicione um tubo das misturas preparadas e continue a incubação. 48 horas depois, transfira a mídia de produção viral dos poços de placa para cônicos e gire-os a 300 g por cinco minutos.
Em seguida, transfira o supernatante para tubos frescos para descartar os detritos pelleted. Agora, use imediatamente a mídia de produção viral para transduzi-la das células-alvo ou congelá-la a 80 graus celsius para uso futuro. Comece com a adição de 250 microliters de cada construção viral de interesse, que neste caso, é composta de plasmídeos CLOud9 complementares a um tubo cônico de 50 mililitros contendo 80.000 células.
Em seguida, adicione polibreno suficiente para que esteja entre um e oito microgramas por mililitro em solução. Em seguida, ajuste o volume total em cada tubo para um mililitro usando mídia livre de antibióticos. Agora, para aumentar o contato entre as partículas do vírus e as células giram as células a 800 g por 30 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, suspenda novamente as células no supernante por pipetação. Em seguida, carregue a suspensão das células em placas de cultura e incuba-as por 24 horas. No dia seguinte, pegue as células.
Centrifuá-los a 300 g por cinco minutos em temperatura ambiente e suspendê-los em meio normal. No dia seguinte, adicione puromicina e higromicina ao meio para selecionar células duplamente transduzidas. A concentração adequada de antibiótico deve ser determinada com antecedência para cada tipo de célula.
Em seguida, incubar as células nos meios de seleção por pelo menos três dias antes de prosseguir com aplicações a jusante e continuar a manter as células e a mídia de seleção. Para escurecer as células selecionadas e transduzidas cloud9 adicionar um milimôe ABA ao prato de cultura. Para controles, adicione DMSO e mantenha as células com ABA ou DMSO durante a duração do experimento.
Para reverter a dimerização, lave as células com PBS suficiente para cobrir a superfície da placa duas vezes. Depois disso, células culturais na mídia livre de ABA para mantê-las em um estado não hipnotizado. O uso adequado do sistema CLOud9 induz o contato reversível das construções complementares CSA e CSP CLOud9 através da adição ou remoção de ABA aos meios de cultura celular.
As construções CSA e CSP são localizadas para regiões genômicas apropriadas usando o guia padrão CRISPR RNAse. A imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR quantitativo foi utilizada para garantir a localização precisa na segmentação de cada componente CLOud9. Além disso, a co-aglomeração com e sem ABA verificou a dimerização de CSA e CSP na presença do ligante, bem como a reversibilidade na ausência do ligante.
Após a dimerização da ABA, maior contato entre a beta-globina e o LCR foi medido pela captura de confirmação do cromossomo. No entanto, isso não foi observado nos controles que continham apenas o CSA ou apenas a construção do CSP. A criação da interação LCR beta-globin não eliminou completamente o contato de globina LCR endógena.
Só foi adicionado ao contato original. O aumento nos contatos LCR beta-globin foram observados através de 72 horas de dimerização, independentemente da região exata dentro do LCR alvo ou da região promotora de beta-globin. Por fim, a reversibilidade do sistema foi confirmada com a captura de confirmação do cromossomo após a remoção da ABA.
Isso resultou na renovação completa da confirmação endógena. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de mudar a mídia e adicionar células transduzidas cloud9 recém-ensacidas todos os dias. Não se esqueça de trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso e todas as precauções usadas no BSL 2 devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.
