A estabilidade de armazenamento de vesículas celulares extras é um parâmetro importante para seu uso terapêutico prospectivo. Nosso protocolo fornece uma ferramenta prontamente aplicável para avaliar como o armazenamento afeta as vesículas. A principal vantagem de nossa técnica é que introduzindo glucuronidase como um marcador exógeno, vesículas extracelulares derivadas de diferentes células-mãe são facilmente comparadas com relação à sua armazenamento.
O fracionamento do fluxo de fluxo assimétrico, ou AF4, é uma alternativa leve à purificação da cromatografia de exclusão de tamanho para compostos muito sensíveis. Porque os compostos encontram menos estresse no canal. Como a glucuronidase é uma enzima sensível, a qualidade do reside beneficia-se do planejamento minucioso e da realização das etapas de purificação e análise de volta para trás.
Depois de cultivar a linha de interesse celular de acordo com as condições padrão para essas células, substitua o supernaente por meio esgotado sem soro ou extra celular e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 24 a 72 horas. No final da incubação, colete o super natant de cada frasco e centrífugue as amostras para sedimentar as células. Colete cuidadosamente o meio condicionado da célula sem perturbar a pelota.
E centrifugar o meio novamente para remover detritos celulares e grandes agregados. Em seguida, transfira cuidadosamente os supernantes em tubos ultracentrífugas. Se usar um rotor de ângulo fixo, marque a orientação dos tubos na centrífuga para facilitar a recuperação da pelota de vesícula extracelular após a centrifugação.
No final da ultracentrifugação, use uma pipeta sorológica para descartar cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota de vesícula extracelular. A 200 microlitadores de 0,2 micrômetros filtrados PBS para o supernatante residual do primeiro tubo ultracentrífuga. Depois de reutilizar a pelota, transfira a suspensão de vesícula extracelular resultante para o próximo tubo para a ressuspensão da pelota subsequente até que todas as pelotas de vesícula extracelular tenham sido resuspendidas.
Adicione glucuronidase beta à solução final de pelotas resuspended a uma concentração final de 1,5 miligramas por mililitro. E saponina para uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro. Em seguida, misture bem por vórtice por três segundos e coloque a reação à temperatura ambiente por 10 minutos com movimento suave intermitente.
Uma vez encapsulada a glucuronidase, certifique-se de realizar todas as etapas subsequentes de avaliação de vesículas de purificação no mesmo dia para obter resultados de estabilidade de armazenamento imparcial. Tenha uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho equilibrada com pelo menos dois volumes de coluna de PBS prontos para purificar a pelota imediatamente após a incubação da saponina. Para purificar, adicione 400 microliters de suspensão vesícula extracelular à coluna.
Em seguida, coletar uma fração mililitro do eluado. Para conformar a separação das vesículas extracelulares das proteínas contaminantes e da glucuronidase livre, meça a concentração de proteínas por ensaio de ácido bicinchonínico de acordo com as instruções dos fabricantes. Utilizando parâmetros otimizados para o respectivo tipo de instrumento e vesícula, utilize um instrumento de análise de rastreamento de partículas nano para medir o tamanho e concentração da vesícula extracelular.
Para medir a atividade de glucuronidase, adicione 25 microliters de fluorescin di-beta-D-glucuronida recém-preparada a 125 microliters das vesículas extracelulares purificadas e adicione a amostra a um poço de uma placa preta de 96 poços. Meça o tempo zero de produção de fluorescina em um leitor de placas a uma excitação de 480 nanômetros e 516 nanômetros. Cubra a placa firmemente com papel alumínio transparente para reduzir a evaporação.
Em seguida, incubar a placa protegida da luz por 18 horas a 37 graus Celsius. Meça a produção de fluorescina de 18 horas no leitor de placas como apenas demonstrado. Para liofilização vesícula extracelular, adicione quatro miligramas por mililitro de trehalose às vesículas purificadas.
E congelar as vesículas a menos 80 graus Celsius por pelo menos uma hora. Para liofilizar as amostras, coloque a temperatura da prateleira de um lyophilizer a 15 graus Celsius e a pressão para 0,180 milibares. Seque as vesículas nessas condições por 46 horas.
No final da etapa principal de secagem, coloque a temperatura da prateleira em 25 graus Celsius e a pressão para 0035 milibaris e seque as amostras por duas horas nessas condições. Em seguida, armazene as amostras liofilizadas a quatro graus Celsius. Para reidratar as amostras após o armazenamento, adicione um volume de água igual ao volume da suspensão vesícula extracelular antes da liofilização.
Para avaliar a atividade enzimática após o armazenamento, carregue um instrumento AF4 com PBS filtrado de 0,1 micrômetro recém-preparado para a fase móvel e insira uma membrana de filtro de 0,1 micrômetro no filtro de entrada de pico após a bomba para reduzir o ruído de partículas do solvente. Depois de desmontar, limpe o pequeno canal para AF4 com água millEq. Hidrate uma nova membrana de celulose regenerada com um peso molecular cortado de 30 kilodaltons e coloque a membrana em cima do traste com o lado brilhante para cima.
Coloque um espaçador de 350 micrômetros abaixo da metade superior do canal e monte as partes do canal. Usando uma chave de fenda de torque, aperte os parafusos primeiro a um torque de cinco metros Newton, depois a um torque de sete metros Newton. Apertando os parafusos ao redor do bloco em um padrão de cruzamento.
Conecte os canais entrada, saída e porta de fluxo cruzado ao eclipse. Em seguida, de pelo menos três amostras antigas para equilibrar a membrana. Programe uma execução fracionada com o fluxo do detector e o fluxo de foco definidos para um mililitro por minuto e um fluxo de injeção de 0,2 mililitros por minuto.
Após um minuto de pré-foco, injete a amostra durante um período de 10 minutos no foco e injete passo, antes de diminuir o fluxo cruzado de dois mililitros por minuto para 0,1 mililitros por minuto ao longo de oito minutos. Finalize a corrida de fracionamento com uma etapa de elução sem fluxo cruzado por 10 minutos e adicione um passo de lavagem de eluição e injeção, seguido de uma elução. Em seguida, equilibre o canal para a próxima corrida com um fluxo cruzado inicial de dois mililitros por minuto e defina o detector UV para 280 nanômetros.
Quando todos os programas tiverem sido definidos, injete 300 microlitros da amostra e registe os sinais de dispersão UV e luz no software ASTRA. Após 12 minutos e meio, comece a coletar uma fração de mililitro até 27 minutos após a injeção. Em seguida, realize um ensaio de glucuronidase e uma análise de rastreamento de partículas nano, como demonstrado.
Aqui, a recuperação de partículas e o tamanho das vesículas extracelulares isoladas das células endoteliais vasculares humanas após sete dias de armazenamento em diferentes condições são mostrados em comparação com uma nova amostra. As vesículas foram posteriormente submetidas à purificação af4 e a atividade de glucuronidase por partícula foi medida. Tanto a cromatografia de exclusão de tamanho quanto a AF4 são bem sucedidas em separar a vesícula extracelular da glucuronidase livre.
Devido ao maior grau de separação para AF4 entre partículas e enzima livre, a contaminação das frações contendo vesículas é menos provável. A purificação do AF4 após o armazenamento remove a enzima livre das amostras e, portanto, reduz a quantidade de atividade enzimápica recuperada por partícula. Este efeito é mais proeminente após o armazenamento a quatro graus Celsius, para o qual observa-se uma redução de 2/3.
Omitir essa etapa adicional de purificação pode levar a uma suposição errada sobre a estabilidade da enzima. A microscopia eletrônica de transmissão não revela grandes diferenças de forma para vesículas extracelulares lioofphilizadas sem um crioprotetor. A varredura de imagens de microscopia eletrônica, no entanto, revela a presença de agregados dentro das amostras liofilizadas que não são encontradas nas amostras armazenadas a menos de 80 graus.
É crucial que a enzima livre seja removida das vesículas antes do ensaio de glucuronidase. Assim, a técnica utilizada para a purificação da vesícula precisa ser minuciosamente avaliada. As partículas purificadas também poderiam ser examinadas em termos de sua carga superficial para descobrir se o armazenamento mudou a composição natural das proteínas ou açúcares da membrana.
Com nossa técnica, é possível obter uma primeira indicação sobre estabilidade do armazenamento de vesícula extracelular, mesmo quando não há marcadores ou ensaios específicos conhecidos para a atividade disponível.
