Este protocolo fornece uma técnica rigorosa e reprodutível para extração e isolamento de pequenas vesículas extracelulares de amostras de tecido inteiro para análises ex-vivo a jusante. Com entre os mais altos níveis de pureza atualmente alcançáveis, este método facilita a morfológica direta, imunofenópica e caracterização profunda de vesículas intersticiais secretadas em vários espécimes teciduais, incluindo tumores. Aqui, demonstramos o isolamento de EVs teciduais de amostras de tumores cerebrais e pulmonares.
No entanto, essa técnica também pode ser aplicada a estudos utilizando amostras de tumores diversos, benignos ou outros tumores. Para começar, prepare 10 mililitros de tampão de dissociação no meio Hibernar-E para cada 0,4 a 1,0 grama de tecido. Adicione tecido fresco ou congelado inteiro ao tampão em um tubo de 50 mililitros e incubar em um banho de água morna a 37 graus celsius por 20 minutos.
Depois disso, adicione inibidores de protease e fosfatase para uma concentração final de 1x no tampão de dissociação. Despeje a solução com o tecido em um homogeneizador de encaixe solto. Use aproximadamente 30 golpes lentos por amostra para dissociar suavemente o tecido.
Em seguida, transfira o tecido dissociado e a solução tampão para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 500x g e a quatro graus celsius por cinco minutos para pelotar as células e as fibras restantes ou fragmentos de tecido coeso. Transfira o supernante para um tubo cônico limpo de 50 mililitros, e centrífuga a 2.000x g e a quatro graus celsius por 10 minutos para pelotas e descarte os grandes detritos celulares.
Transfira este supernante para um tubo cônico limpo de 50 mililitros, e centrífuga a 10.000x g e a quatro graus celsius por 40 minutos para cápsular quaisquer vesículas maiores indesejadas ou pequenos corpos apoptóticos. Decante o supernatante através de um filtro de 0,45 micrômetros em um tubo de ultracentrifugação de 12 mililitros limpo. Em seguida, ultracentrifuuge a amostra a 100.000x g e a quatro graus celsius por duas horas, para pelotar pequenos EVs.
Decante o supernasce e deixe os tubos de ultracentrifugação invertidos por cinco a 10 minutos, tocando frequentemente para remover qualquer líquido residual nas laterais dos tubos. Em seguida, resuspense a pelota EV em 1,5 mililitros de 0,25 tampão de sacarose molar. Cubra os tubos com Parafilm e, em seguida, vórtice dos EVs em solução.
Balance os tubos de ultracentrifuagem por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. E então vórtice mais uma vez. Centrifufique brevemente os tubos a uma velocidade inferior a 1.000x g para recuperar a suspensão líquida na parte inferior do tubo.
Se necessário, armazene a suspensão a 4 graus celsius durante a noite. Primeiro, adicione 1,5 mililitros de 60% iodixanol aos 1,5 mililitros do tampão tris de sacarose que contém os EVs para criar uma solução final contendo 30% de iodixanol. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar a solução completamente.
Transfira esta solução para a parte inferior de um tubo de ultracentrifugação de 5,5 mililitros. Em seguida, misture o estoque de 60% iodixanol com água ultra pura para preparar pelo menos 1,5 mililitros de uma solução de 20% e 10% iodixanol. Usando uma seringa e uma agulha de calibre 18, meça 1,3 mililitros da solução de 20% iodixanol e coloque-a cuidadosamente em camadas em cima do gradiente inferior.
Mantenha o chanfrado da agulha em contato com o interior do tubo, logo acima do menisco e adicione a solução de gota sábia para evitar misturar as camadas na interface de densidade. Em seguida, camada 1.2 mililitros da solução 10% iodixanol em cima da camada de 20%, usando a mesma técnica. Equilibre cuidadosamente e carregue os tubos de ultracentrifugação em baldes de rotor.
Defina as velocidades de aceleração e desaceleração de um rotor de balde de balanço para as taxas mínimas, e centrífuga em 268,000x g e a quatro graus celsius por 50 minutos. Enquanto a amostra está sendo centrifugada, rotule 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada amostra que corresponderá com frações de um a 10 do gradiente de densidade. Uma vez que a centrifugação esteja completa, remova suavemente os tubos dos baldes do rotor e coloque-os em um suporte estável.
Pipeta 10 frações seriais de 490 microliters do topo do gradiente para os tubos correspondentes. Utilizando um refratômetro, meça os índices refrativos das frações. Em seguida, transfira cada fração para um tubo de ultracentrifugação de 12 mililitros limpo.
Adicione cinco mililitros de 1x PBS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo lentamente para misturar. Adicione mais seis mililitros de 1x PBS na parte superior do tubo, e misture cuidadosamente novamente. Ultracentrificar os tubos a 100.000x g e a quatro graus celsius para re-pelotar as pequenas vesículas.
Decante o supernaspe e bata os tubos secos antes de lise as vesículas para análise de proteínas ou reresusundo os EVs para análise morfológica. Para lise os EVs para análise de proteínas, adicione 40 microliters de forte tampão de lise contendo inibidor de protease às pelotas EV. Coloque Parafilm sobre cada tubo e vórtice vigorosamente.
Em seguida, balance os tubos por 20 minutos em temperatura ambiente e vórtice novamente. Centrifufique brevemente a amostra a 1.000x g por 30 a 60 segundos para recuperar todo o volume da amostra. Transfira cada amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e armazene-a a uma temperatura entre 20 e 80 graus celsius até estar pronta para processamento posterior.
Para preparar os lises purificados para análise de imunoblot, adicione 5x tampão de amostra de Laemmli às amostras para uma concentração final de 1x. Ferva a amostra a 95 graus celsius por cinco a 10 minutos. Em seguida, carregue um volume igual de frações de uma a 10 em um gel de página SDS de 10%.
Carregue uma massa igual de homogeneizar o tecido. Realize a eletroforese e a análise de manchas ocidentais para confirmar as proteínas EV nos lises purificados e comparar a abundância relativa de EV em frações. Neste estudo, vesículas extracelulares são extraídas e purificadas de tecido inteiro.
Após a ultracentrifugação do gradiente de 10 a 30%, uma população de EVs leves pode ser vista migrando até a fração dois, enquanto uma população de EVs densa pode ser vista migrando até a fração cinco, dependendo do tipo de tecido. Os imunoblots representativos das frações gradientes exibem a separação eficiente e purificação de pequenos EVs derivados de tumores na fração cinco. Notavelmente, os espécimes de tumores pulmonares aparecem enriquecidos em EVs densos em comparação com EVs leves que foram previamente colhidos de tecido cerebral inteiro.
A análise representativa do rastreamento de nano partículas e a microscopia eletrônica de vesículas derivadas de tecido na vesícula predominante contendo fração demonstram o enriquecimento e preservação de vesículas inteiras. Consistente com o tamanho e estrutura conhecidos de pequenos EVs. Os EVs intersticiais representam alvos promissores para o desenvolvimento de novos ensaios biomarcadores diagnósticos ou prognósticos.
Esta técnica fornece aos pesquisadores ferramentas para a extração e purificação de vesículas para utilidade a jusante. Após a extração de EVs de tecido inteiro ou lised, pode ser realizada uma caracterização ampla de vesículas, incluindo análises proteômicas, genômicas e lipidômicas. Além disso, as amostras podem ser usadas para abordagens mais direcionadas.
Vesículas isoladas diretamente de amostras de tecidos podem fornecer mais informações sobre mecanismos de doença, incluindo gênese tumoral, e podem fornecer importantes ferramentas diagnósticas ou prognósticos no futuro.
