Este protocolo descreve alguns métodos para quantificar a formação de gotículas lipídicas em organoides intestinais humanos. Pode ser usado como uma plataforma de triagem de alto rendimento para testar drogas que modulam a formação de gotículas lipídicas. O método que descrevemos é baseado em um corante específico de gotícula lipídica e organoides intestinais derivados da biópsia.
Assim, fornece um modelo estável, preciso e fisiologicamente relevante para a formação de gotículas lipídicas. Este protocolo pode ser usado para triagem para candidatos a novos medicamentos específicos do paciente que modulam a formação de gotículas lipídicas, por exemplo, em pacientes com deficiência de DGAT1. Este ensaio de formação de gotículas lipídicas também pode ser aplicado a outros tipos de culturas organoides para estudar o metabolismo lipídico em outros tipos de células.
O ensaio depende, em certa medida, da densidade da cultura organoide. Tente garantir uma densidade organoide consistente entre amostras e experimentos. A demonstração visual deste ensaio é fundamental porque é importante mostrar como o organoide deve ser cultivado e como eles devem ser tratados para garantir a análise adequada da formação de gotículas lipídicas.
Depois de preparar os organoides, aspire cuidadosamente o meio cultural sem perturbar as gotículas da matriz de membrana do porão. Adicione 500 microliters de meio basal frio ao primeiro poço de organoides. Usando uma pipeta P1000, pipeta suavemente para cima e para baixo para interromper as gotículas da matriz da membrana do porão com organoides.
Repita este procedimento com o mesmo meio no próximo, bem como necessário, mas não colher mais de dois poços por 500 microliters de meio basal. Colete os organoides em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro de baixa ligação e gire-os em uma centrífuga mini-mesa por 15 a 20 segundos. Adicione 400 microliters de trippsina aos organoides girados.
Incubar em um banho de água a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, use uma pipeta P200 para in pipeta suavemente a suspensão para cima e para baixo para interromper os restantes agregados de células. Incubar em um banho de água a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Quando restar apenas células únicas, adicione um mililitro de meio basal e gire as células em uma centrífuga mini-mesa por 15 a 20 segundos. Aspire completamente o supernatante. Use uma pipeta P200 para suspender as células únicas em 200 microliters de hSI-EM frescos, e adicionar mais 800 microliters de hSI-EM.
Em seguida, conte o número de células em suspensão e calcule o volume de células necessárias para a densidade celular final. Tire o volume adequado da suspensão e ajuste a densidade para 750 células por microliter. Adicione a matriz da membrana do porão à suspensão celular em uma proporção de dois para um.
Pipeta suavemente a suspensão para misturar cuidado para evitar criar bolhas. Em uma placa de cultura pré-aquecida, semeeou três gotículas de 10 microliter por poço se a placa tiver 24 poços ou uma gota de cinco microliter por poço se a placa tiver 96 poços. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 a 15 minutos para solidificar as gotículas.
Enquanto isso, pré-aqueça um volume apropriado de hSI-EM+Y em um banho de água a 37 graus Celsius. Depois disso, adicione cuidadosamente o hSI-EM+Y pré-aquecido a cada poço da placa. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Depois de dois a três dias, substitua o meio por hSI-EM e certifique-se de atualizá-lo duas a três vezes por semana. Primeiro, pesar 0,2 gramas de ácido oleico líquido à temperatura ambiente. Adicione 1,5 mililitros de PBS estéreis de grau cultural e aqueça a mistura a 70 graus Celsius por uma hora, certificando-se de vórtice intermitentemente.
Em seguida, pese 5,89 gramas de BSA livre de ácidos graxos e dissolve-o em 33,9 mililitros de PBS. Aqueça a mistura em um banho de água a 37 graus Celsius até que a BSA esteja totalmente dissolvida. Vórtice a mistura de ácido oleico novamente para criar uma emulsão de gotículas finas e adicioná-lo imediatamente à solução BSA usando uma pipeta de vidro.
Mantenha a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos até que uma solução amarelada clara permaneça. Passagem dos organoides como descrito anteriormente e semear as células únicas derivadas de organoides em uma placa de fundo claro preto 96-bem. No sexto dia de cultivo no hSI-EM, substitua o meio de cultura por hSI-EM contendo um mililitro do ácido oleico e conjugado BSA.
Incubar as células por 16 a 17 horas a 37 graus Celsius na presença ou ausência de 0,1 inibidor micromolar DGAT1. Depois disso, aspire o meio sem perturbar as gotículas da matriz de membrana do porão. Fixar os organoides adicionando 100 microlitadores de 4% de formaldeído tamponado neutro aos poços por 30 minutos à temperatura ambiente.
Remova o formaldeído suavemente e lave cuidadosamente as células com 150 microliters de PBS por poço. Manche as células para gotículas lipídicas com 025 miligramas por mililitro LD540 e DAPI em PBS por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, lave os poços cuidadosamente com PBS.
Para imagens de visão geral de organoides inteiros use um subjetivo 40X adequado para imagens fluorescentes confocal. Defina o microscópio para imagem para DAPI e o corante LD540 usando as configurações de excitação e emissão mostradas aqui. Ajuste o tamanho do orifício em uma unidade arejada para resolução suficiente do eixo Z.
Para a imagem, metade de um organoide esférico estabelece uma pilha de z para aproximadamente 85 micrômetros. Usando um sistema de processamento de imagem apropriado, transforme a pilha z de cada organoide em uma projeção máxima clicando em Imagem, Stacks, Z Project. Defina o limiar da projeção máxima para um nível no qual não há sinal LD540 visível na amostra de controle do veículo BSA clicando em Imagem, Ajuste, Limiar.
Use essas configurações para limiar cada imagem. Em seguida, meça a área total de fluorescência para cada projeção máxima usando a função Analisar, Analisar Partículas. Para uma análise adequada da formação de gotículas lipídicas, os organoides não devem ser semeados muito densamente antes da estimulação com ácido oleico e posterior coloração.
Isso é especialmente importante para a leitura confocal e leitor de placas, uma vez que organoides sobrepostos podem interferir na fluorescência. Após a estimulação com um milimólar de ácido oleico durante a noite, a formação de gotículas lipídicas pode ser visualizada com um microscópio de campo brilhante invertido. O acúmulo de gotículas lipídicas dispersa a luz transmitida, e, portanto, os organoides parecem mais escuros, enquanto organoides não estimulados têm uma aparência translúcida.
Uma vez que os organoides estimulados pelo ácido oleico são fixos e manchados, a formação de gotículas lipídicas pode ser visualizada usando um microscópio confocal. Como os organoides são estruturas 3D, um microscópio epifluorescente regular não é adequado devido ao sinal de fundo fora de foco, de modo que uma pilha z confocal é usada para caracterizar LDF em organoides. A quantificação das amostras de microscopia confocal também pode ser realizada usando um leitor de placa fluorescente normalizado ao sinal de Hoechst fluorescente.
O ensaio do leitor de placas indica uma diminuição significativa do sinal LD540 em células organoides tratadas com inibidor DGAT1 em comparação com organoides não tratados. A quantificação da formação de LD em células individuais pode ser alcançada usando um citômetro de fluxo. A estratégia de gating mostrada aqui é para organoides intestinais humanos dissociados.
Histogramas representativos tanto para o SSC-A quanto para o sinal LD540 da população final de células vivas mostram que a formação de gotículas lipídicas resultará em um aumento no SSC-A devido à formação de gotículas lipídicas intracelulares. Além disso, as manchas de LD540 para lipídios que são armazenadas nas gotículas lipídicas, e o sinal também aumentará após a indução da formação de gotículas lipídicas. Como tal, a formação de gotículas lipídicas é medida como uma mudança na intensidade fluorescente média tanto do SSC-A quanto do LD540.
Os passos mais cruciais deste protocolo são a cultura dos organoides intestinais humanos e a corrugação adequada do ácido oleico à BSA. Para acomodar mais condições, este ensaio pode ser analisado usando um leitor de placa fluorescente. Para corrigir o número organoide por poço, o sinal LD540 foi normalizado para o sinal DAPI.
Com essa técnica, os pesquisadores podem estudar a formação de gotículas lipídicas em sistemas organoides, e melhorar várias técnicas de análise, como microscopia eletrônica para validar seus achados.
