Com o objetivo de investigar a integridade da barreira intestinal, desenvolvemos um método para medir a integridade da barreira intestinal em pequenos organoides intestinais. Em contraste, nos referimos à cultura celular monocamada usada, nosso ensaio é baseado em organoides intestinais tridimensionais. Adaptar um ensaio bidimensional ao nosso modelo foi essencial para sua praticidade.
O ensaio é baseado em organoides cultivados in vitro e sua aplicação ajudará a definir indutores e inibidores da integridade da barreira intestinal. A regulação de proteínas de junção apertadas é uma característica importante de todas as células epiteliais. Nosso ensaio permite a função e análise da integridade da barreira epitelial.
Para medir a integridade da barreira de organoides isolados do tecido intestinal do camundongo, primeiro precoat todos os tubos de centrifugação que serão usados para armazenar os organoides durante o processo de chapeamento com BSA suficiente em PBS para cobrir todas as superfícies plásticas. Remova imediatamente a solução BSA e coloque os tubos no gelo. Em seguida, descongele a solução da matriz celular e o meio de cultura organoide no gelo e remova cuidadosamente o meio de cultura de cada poço de uma placa de cultura organoide de 48 poços.
Lave cada poço com um mililitro de PBS frio antes de pipetar vigorosamente para dissolver as matrizes celulares. Quando foram obtidas suspensões celulares relativamente homogêneas, lave os organoides com PBS fresco duas vezes por centrifugação e resuspenque cada cultura organoide em 40 microliters de meio frio. Dissociar as grandes estruturas organoides através de uma dica de pipeta de 10 microliteres cinco vezes para coletar estruturas com um tamanho de 40 a 60 micrômetros e misturar cada suspensão organoide com 40 microlitrais de solução de matriz celular recém-preparada.
Adicione cada suspensão da solução de matriz celular organoide no centro de poços individuais de uma tampa de oito câmaras bem colocada e coloque o slide em um bloco de gelo por cinco minutos. Ao final da incubação, coloque o slide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 20 minutos para permitir a polimerização da estrutura da matriz celular organoide antes de adicionar 150 microliters de cultura organoide média a cada poço para uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular. No final da incubação, trate os poços de controle positivo com 10 nanogramas por mililitro de gamma de interferon murina recombinante por 48 horas.
Para realizar um ensaio de permeabilidade, transfira o deslizamento de coberturas câmara para a câmara de incubação aquecida de 37 graus Celsius de um microscópio confocal invertido e ajuste o dióxido de carbono da câmara para 5%Bloqueie o deslizamento firmemente no palco do microscópio e ajuste as configurações de imagem do microscópio para visualizar os organoides em um poço da câmara. Em seguida, adicione três microlitros de 100 mililitros amarelos de lúcifer recém-preparados em 150 microlitros de médio a um poço para uma hora de incubação na câmara de microscópio. Ao final da incubação, ajuste o foco para visualizar o lúmen do organoide de referência e defina a energia laser necessária para a excitação amarela de Lúcifer e a respectiva sensibilidade de detecção do instrumento para imagem do sinal amarelo Lúcifer em 30 a 40% do alcance dinâmico disponível do instrumento.
Alternativamente, a intensidade do sinal pode ser modificada alterando o tempo de exposição. Encontrar as posições de cerca de 10 organoides com uma estrutura esférica próxima à superfície de deslizamento por poço, por interferência diferencial, contraste imagens ao vivo, capturando organoides com diâmetros comparáveis e focando na fatia central dos organoides para a imagem dos lúmens. Regisso contraste de interferência diferencial e a fluorescência amarela lúcifer de cada posição para documentar a forma e a auto-fluorescência de cada organoide.
Quando todos os organoides tiverem sido imagens, adicione 150 microliters de meio, incluindo amarelo Lúcifer, aos poços de tratamento amarelo Lúcifer e imagem todos os poços a cada cinco minutos por 70 minutos. No final da sessão de imagem, adicione quatro microliters de EGTA recém-preparado a 100 microliters de médio. Adicione o EGTA diluído aos poços apropriados.
Então, registo a fluorescência dos organoides em cada poço a cada cinco minutos por 30 minutos. Certifique-se de praticar o manuseio e cultura ou organoides com antecedência, pois a viabilidade e a integridade celular são um pré-requisito para o sucesso do ensaio. Neste experimento representativo, após 70 minutos de tratamento com fluorescência amarela lúcifer amarelo lúcifer só foi visível em organoides de animais do tipo selvagem tratados com gama interferon.
Nem controles não estimulados, nem organoides derivados de animais de interferon gama receptor-2 apresentaram fluorescência amarela lúcifer intraluminal no final do período de tratamento. A adição do EGTA causou um colapso inespecífico da integridade da barreira intestinal, sequestrando cofatores de junção apertados, resultando em lúcifer amarelo take-up e expressão em todos os organoides, independentemente da origem ou condições de tratamento. Os valores de intensidade relativa para o nível de fluorescência amarela lúcifer dentro do lúmen organoide e fora de cada organoide também podem ser quantificados.
Certifique-se de selecionar organoides com um tamanho comparável em torno da configuração e selecionar o eixo definido para que você possa imaginar o lúmen central do organoide. Além do uso de substâncias que induzem a quebra da barreira intestinal, também podemos investigar estratégias para a inibição da destruição da barreira intestinal. Como essa metodologia é baseada em células primárias de um único animal, ela pode ser usada para muitos ensaios, reduzindo o número de animais necessários para cada experimento.
