Sistemas microfisiológicos têm a capacidade de emular a resposta farmacocinética e toxicológica do corpo humano a tratamentos específicos de interesses. Sistemas microfisiológicos têm o potencial de substituir testes em animais, pois seu uso pode melhorar o poder preditivo dos métodos in vitro e reduzir o custo e o tempo de estudos farmacocinéticos e toxicológicos. 24 horas antes da administração da substância de teste, divida uma alíquota de 800 microliteres de médio William ES entre os compartimentos maiores e menores do chip de dois órgãos, e aspire o meio basolateral e apical de cada barreira intestinal equivalente nas 24 placas de poço preparadas.
Usando fórceps estéreis, integre uma inserção por dois circuitos de chip de órgão no compartimento maior e adicione 200 microliters de DMEMS ao lado apical. Usando pontas largas de furo, integre 20 equivalentes hepáticos por circuito no compartimento menor do chip de dois órgãos e conecte o sistema à unidade de controle. Em seguida, conecte a unidade de controle a uma fonte de ar pressurizada e coloque a pressão em aproximadamente mais ou menos 300 barras e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hertz.
No dia seguinte, diluir a solução de acetaminofeno de estoque para uma concentração de 12 micromolares. Para substituir o meio no sistema, aspire a mídia basolateral e apical a partir da barreira intestinal equivalente no chip de dois órgãos e adicione 500 microliters de meio de cultura fresco apropriado no grande compartimento no lado organoide basolateral e 300 microlitres ao pequeno compartimento. Após verificar bolhas, emule a administração oral com a adição de 200 microliters de uma solução de acetaminofeno de 12 micromolares no lado apical da cultura intestinal e conecte o sistema microfisiológico à unidade de controle.
Colete o volume total tanto dos lados apical e basolateral intestinal, quanto do pequeno compartimento em triplicado nos pontos de tempo indicados. Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, defina todos os parâmetros relevantes para a análise do HPLC conforme indicado na tabela e filtre a fase móvel através de um filtro de membrana de 0,4 míccros sob vácuo. Em seguida, filtre as amostras através de um filtro de seringa PVDF tamanho 0,22 mícrons e armazene as amostras em um frasco antes de iniciar a medição UV hplc.
Para avaliar a viabilidade organoide, transfira todos os 20 esferoides de cada um se replicar para poços individuais de uma placa de poço 96 e transfira as inserções da cultura celular para poços individuais de uma placa de 24 poços. Lave os equivalentes teciduais três vezes com DPBS frescos por lavagem e adicione 300 microliters de uma solução de um mililitro MTT a cada poço experimental. Após uma incubação de três horas na incubadora de cultura celular, substitua a solução MTT por 200 microlitrais de isopropanol por poço para uma incubação noturna a quatro graus Celsius para extrair o formazan MTT do intestino e equivalentes hepáticos.
Na manhã seguinte, transfira 200 microlitadores de cada supernante para o poço apropriado na placa de poço 96 e leia o formazan em um leitor de placas a 570 nanômetros para permitir o cálculo da capacidade relativa das células de reduzir o MTT usando a densidade óptica média de cada ponto de tempo em comparação com o controle negativo. Para análise citoquímica e histológica das amostras, primeiro fixe o intestino e os equivalentes hepáticos em 4% de paraformaldeído em 0,1 PBS molar por 25 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os organoides cinco vezes em PBS por 10 minutos por lavagem, antes de coloricar os equivalentes intestinais e hepáticos com tetrametilodamina isotocianato phalloidin Alexa Fluor 647 por uma hora à temperatura ambiente.
No final da incubação, transfira as amostras para o meio de congelamento por alguns minutos antes de encaixe congelar os tecidos em nitrogênio líquido. Em seguida, use um criostat para adquirir crio-seções de crioide spheroid de fígado de 10 a 12 mícrons de espessura e montar as seções teciduais em meio de montagem com DAPI para imagem por microscopia de fluorescência de confocal. Para coloração mitocondrial e nuclear, cubra completamente as amostras com solução de coloração mitocondrial para uma incubação de 15 a 45 minutos a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono.
Ao final da incubação, substitua cuidadosamente a solução de coloração por 2 a 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, enxágue suavemente as células duas vezes com PBS fresco por cinco minutos por lavagem antes de rotular as amostras com solução de trabalho de coloração de ácido nucleico por 10 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, lave as amostras com três, cinco minutos de lavagem em PBS protegidas da luz, e use a mancha de ácido nucleico para facilitar a quantificação do número de células expressas de manchas mitocondriais em um microscópio fluorescente com os conjuntos de filtros apropriados.
Integrar a barreira intestinal humana e um equivalente hepático em um dispositivo microfluido de dois chips de órgão permite a avaliação das propriedades farmacocinéticas e toxicológicas dos tratamentos de interesse. Após o tratamento, as amostras de mídia podem ser analisadas pelo HPLC. Os organoides podem ser analisados por sua expressão genética, valores de resistência elétrica trans-epitelial e expressão e atividade proteica, bem como por suas características morfológicas.
A análise de MTT pode ser realizada para avaliar a viabilidade organoide, bem como para detectar eventos tóxicos muito precoces em resposta ao tratamento de acetaminofeno. O fluxo de mídia não afeta significativamente a absorção de acetaminofeno, enquanto melhora significativamente a funcionalidade equivalente hepática, indicando que a absorção de acetaminofeno intestinal humano e o metabolismo hepático podem ser emulados neste sistema microfisiológico. Sistemas microfisiológicos têm o potencial de substituir modelos animais no desenvolvimento e descoberta de medicamentos, pois imitam melhor a fisiologia humana e podem ser usados para promover o desenvolvimento de medicamentos em maior velocidade e menor custo para o risco e complexidade.
