A medição direta de água, proteínas e lipídios com resolução de profundidade em seres humanos é muito importante para doenças relacionadas à pele, para a caracterização do desempenho do produto skincare. Este método, juntamente com a análise subsequente, aproveita a quimiometria para extrair informações químicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os dados clínicos de Raman sejam coletados por operadores de instrumentos treinados que não possuem conhecimento técnico para identificar, excluir e remediar todas as fontes de artefatos espectroscópicos.
O conjunto de dados resultante pode então ser processado para identificar outliers que precisam ser excluídos da data anterior à análise. Durante a análise dos dados, um desafio fundamental é a remoção dos outliers e a identificação do número dos componentes-chave no conjunto de dados. A abordagem mostra neste vídeo alavanca o conhecimento prévio do conjunto de dados clínicos e a abordagem da quimioterapia para extrair com sucesso a água, proteína e lipídio com resolução de profundidade.
Demonstrando o procedimento estará Li Yang, técnico do nosso laboratório de C&T. Para começar, coloque o sujeito em local marcado do corpo da lesão ou local de controle em contato próximo com a janela de imagem do instrumento In vivo confocal Raman. Certifique-se de que eles cobrem toda a janela para evitar o impacto da luz do quarto na imagem.
Em seguida, abra o software e mova o foco até que um espectro semelhante ao mostrado aqui, seja visto. Depois, mova o foco a 10 mícrons da superfície da pele. Colete dados para 26 etapas com um tamanho de passo de dois mícrons na região de frequência mostrada aqui, usando um tempo de exposição de um segundo.
Meça oito réplicas para cada área, com duração de até 15 minutos no total. Primeiro, use a janela de comando e o MATLAB para alterar a extensão do arquivo dos dados coletados de ric para mat. Em seguida, carregue o arquivo do tapete para a plataforma de software MATLAB, como mostrado aqui.
Corrija a linha de base do conjunto de dados usando o método de menos quadrados ponderados automáticos, indo para a janela PLS_Workspace e clicando com o botão direito do mouse no conjunto de dados importado, rolando para Analisar, selecionando Outras Ferramentas e clicando em Pré-processamento. Na janela que aparece, clique em Mostrar. Em seguida, role a barra de ferramentas Métodos Disponíveis para a filtragem da linha de base de quadrados ponderados automáticos e selecione Adicionar.
Em seguida, clique em Ok para definir as opções e para aplicar o pré-processamento aos dados. Guarde isso como Spectra_baseline. Em seguida, retorne à janela de comando e substitua os dados usando o resultado corrigido na linha de base.
Agora, vá ao Editor de Texto e execute o programa como mostrado aqui. Isso resumirá os valores entre 2910 e 2965 centímetros inversos para obter os valores de intensidade sob cada espectro Raman a partir da medição de 26 etapas consecutivas e armazená-los em um arquivo Excel. No MATLAB, vá até o Espaço de Trabalho e defina o caminho para os dados em Depth_save, como mostrado.
Em seguida, use o processo descrito aqui para interpolar o valor de deslocamento do instrumento de 26 a 260 usando a função linspace no MATLAB. Este processo interpolará o valor de intensidade de 26 a 260 utilizando o método spline, aproveitando os valores de posição recém-gerados 260. Além disso, utilizará os valores de posição e intensidade 260 como entradas x e y para a função de polifit, respectivamente, definindo o valor do grau para 20.
Em seguida, utilizará os coeficientes de saída e os 260 valores de posição estendidas como entrada para polival, para obter os valores finais de intensidade de 260. Em seguida, calculará a intensidade média e encontrará o ponto na curva que está mais próxima da intensidade média. Também mudará o valor de profundidade de acordo com a superfície da pele, no conhecido tamanho do passo de dois mícrons.
Agora, execute o programa. Carregue o conjunto de dados de espectro raman após a remoção do espectro externo da pele no software PLS_Toolbox, sob a plataforma MATLAB e clique com o botão direito do mouse no conjunto de dados para escolher Analisar e, em seguida, selecione PCA. Em seguida, clique em Escolher Pré-processamento.
Selecione Normalizar como a abordagem de pré-processamento. Em seguida, escolha nenhum para a validação cruzada. Em seguida, construa o modelo usando os três componentes para a análise de decomposição do PCA.
Agora, remova a tampa da janela de coleta do instrumento In vivo Ramen e colete os espectros de luz da sala na região de alta frequência usando os mesmos parâmetros utilizados para a coleta de dados do material de referência. Identifique o fator de efeito de luz da sala através da comparação com o fundo de luz da sala. Agora, revise os escores e remova os espectros com o valor de pontuação correspondente significativamente maior do que o normal.
Isso significa a remoção de valores de pontuação de mais de 99,8% de todo o conjunto de dados, o que é de 0,16 neste estudo. Salve os dados de bloco X de calibração resultantes. Finalmente, vá para o PLS_Workspace Browser e edite o novo arquivo.
Selecione os rótulos de linha e vá para Hard Delete Excluded para excluir permanentemente os dados excluídos antes de re-salvar o arquivo. Comece corrigindo a linha de base do espectro raman usando o mesmo apenas mostrado. Em seguida, realize a análise do PCA no conjunto de dados pré-processados.
Plote os valores eigen em escala logarítmica junto com o número de componentes clicando no botão Escolher componentes e selecione log(eigenvalues) como o valor y. Para realizar a análise de resolução de curvas multivariadas, primeiro use o botão de seleção de dados para carregar os dados definidos no software MCR_main. Escolha manualmente o número de componentes e defina o número do componente entre três e oito.
Em seguida, na guia Estimativa Inicial, clique no botão Puro. Em seguida, selecione Concentração e clique no botão Fazer. Uma vez que a tela se atualize, clique no botão Ok e, em seguida, continue a mover-se para a próxima página.
Agora, clique em Continuar e, em Implementação, aplique fnnls. Em seguida, selecione seis no menu suspenso para o número de espécies com perfis de não negatividade e clique em Continuar. Na próxima página, escolha os mesmos parâmetros e clique em Continuar.
Para determinar a localização na superfície da pele, a área sob o pico raman da proteína foi integrada para obter o perfil de profundidade do sinal proteico. A superfície da pele foi definida como o local onde o valor de intensidade do perfil de profundidade interpolado estava mais próximo da intensidade média. A localização exata da superfície da pele não precisa coincidir com um ponto de dados experimental.
Um total de 30.862 espectros raman foram coletados com o protocolo de coleta de dados descrito neste vídeo. Este grande conjunto de dados espectrais contém outliers espectrais de 20%. A identificação e remoção adequada dos espectros outlier é importante para alcançar um conjunto de dados adequado.
Aqui, pode-se ver a contribuição das luzes da sala, sobrepostas a um espectro de referência da Roomlight. A análise dos componentes principais foi realizada no conjunto de dados confocal Raman pré-processado, e o eigenvalue, juntamente com o número de fatores utilizados, são plotados aqui. Observou-se diminuição significativa do valor do eigenvalue para o fator nove.
Esta observação sugere a investigação de modelos com o número de componentes principais variando entre três e oito fatores para inclusão no modelo de resolução de curvas multivariadas. Ao tentar este procedimento, é fundamental iniciar um perfil de profundidade acima da superfície da pele, para determinar com precisão a localização da superfície da pele. Essa metodologia permite a investigação sobre o impacto dos produtos de skincare nos principais componentes da pele, incluindo água, proteínas e lipídios.
