Gostaríamos de agradecer Iwan Schie e Sebastian Wachsmann-Hogiu por suas contribuições no desenvolvimento da técnica de DR-CARS. Semanas Tyler reconhece o apoio do Programa Acadêmico de Lawrence Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser é grato pelo apoio da Associação Americana do Coração, através do programa Bolsa-in-Aid. Este trabalho também foi apoiado em parte graças ao financiamento da National Science Foundation. O Centro de Biophotonics, um NSF Ciência e Tecnologia Center, é gerido pela Universidade da Califórnia, em Davis, nos termos do Acordo de Cooperação n º 0120999 PHY. O suporte também é reconhecido a partir do Centro de Ciências Clínicas UCD translacional em conceder número UL1 RR024146 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (NCRR).

1. Geração de carros e DR-CARS Sinais A fim de gerar CARS e DR-CARS sinais simultaneamente, três sintonizável e sincronizadas curto fontes de laser pulsado são obrigatórios. <ol><li> Para obter três pulsos sincronizados começamos com uma única de 10 W laser (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Este laser tem um comprimento de onda fixo de 1064 nm, um comprimento de pulso fixa de 7 ps, e taxa de repetição de 76 MHz fixos. </li><li> Usando uma série de meia onda placas e polarização divisor de feixe cubos o feixe é dividido em três partes. Uma placa de meia onda combinada com um cubo divisor de feixe de polarização que nos permite ajustar a quantidade de energia em cada componente do feixe sem alterar sua direção. Normalmente, os dois feixes são ajustados para ~ 4,5 W cada, eo feixe terceiro contém os restantes 1 W. </li><li> Os dois feixes de alta potência são, então, dirigido em dois osciladores paramétricos ópticos independentes (OPO, o Avante, APE GmbH, Berlin, Alemanha). Use OPO de geração de freqüência diferença para converter um fóton de maior energia em dois fótons de baixa energia com comprimentos de onda diferentes. Ao controlar a temperatura do cristal usado para conseguir esse efeito, os comprimentos de onda dos fótons resultantes podem ser controlados para dentro de 0,1 nm. Pela freqüência de duplicação estes sinais, um laser com um comprimento de onda fixo de 1064 nm pode agora ser transformada em um feixe de laser que pode ser sintonizado em qualquer lugar entre 780 nm até 910 nm. Bombeando dois separados OPO com a mesma fonte nm 1064, obtemos duas fontes de laser independentemente ajustáveis ​​que são automaticamente sincronizados com nosso laser bomba original. </li><li> O feixe (potência mais baixa), terceiro do laser da bomba 1064 nm é dirigido em torno da OPO é por uma combinação de espelhos dicróicos de modo que todas as três vigas (2 a partir do OPOS, 1 do laser da bomba) pode ser recombinados mais tarde. , A fim de produzir eficientemente coerente fótons do sinal Raman os pulsos recombinados devem ser sobrepostas tanto temporal e espacialmente. OPO porque contêm cavidades anel, permitindo que cada pulso de laser para passar os tempos de cristal múltiplas, as vigas enviados através de viagens a OPO é uma distância extra, resultando em um atraso considerável em relação ao feixe de bomba original. Esta distância deve ser compensado com o feixe de terceiro através da introdução de espelhos força extra que este feixe de viajar à mesma distância que os outros dois antes que eles são recombinados usando espelhos dicróicos. </li><li> A fim de proporcionar o ajuste fino do comprimento do caminho de cada raio viaja estágios atraso ajustável, utilizando retrorefletores prisma, são introduzidos em cada caminho do feixe. </li><li> Outro conjunto de meia onda placas e cubos de feixe polarizador divisor são adicionados a cada feixe para que possamos ajustar a potência de cada feixe de forma independente, sem afetar a entrada do da OPO. </li><li> Espelhos dicróicos são usados ​​para combinar o primeiro dos dois feixes de OPO e, em seguida, com o feixe de 1064 nm. Cuidados devem ser tomados para garantir que as vigas são precisamente sobrepostas (isto é, são colineares e têm divergência similar). Isto pode ser verificado através da comparação da sobreposição dos feixes de perto (dentro de alguns centímetros) e longe (~ 1 m) o espelho dicróico. </li><li> A vantagem de usar lasers pulsados ​​é que cada pulso pode ter um pico de energia de alta na amostra, permitindo a geração eficiente de sinais Raman coerente, mantendo uma intensidade média baixa. A intensidade média elevada pode danificar a amostra. Portanto, a fim de controlar ainda mais a intensidade média, sem sacrificar a energia de pico, os três feixes combinados são enviados através de um modulador eletro-óptico (célula Pockel, o ConOptics) funcionando como um selecionador de pulso, o que nos permite ajustar a taxa de repetição dos pulsos que chegar a nossa amostra e, portanto, a intensidade média. </li><li> Os feixes de laser são então combinados acoplada em um microscópio invertido com um objetivo NA alta. O objetivo é tipicamente uma lente objetiva 60 X de água com uma abertura numérica (NA) de 1,2, que foi corrigida para a aberração cromática em toda a gama de tunability do nosso OPO eo feixe de 1064 nm. O apertado foco gerado pela lente de alta objetivo NA permite a geração mais eficiente de sinais coerentes Raman na escala mícron. </li><li> Os feixes combinados são expandidos, a fim de sobrecarregue a volta da porta da objetiva do microscópio. Por overfilling parte de trás da objetiva do microscópio, podemos alcançar as melhores condições e, portanto, focando a melhor resolução espacial em nosso sistema de microscópio. </li><li> A lente objetiva em nosso microscópio é montada em um palco piezo XYZ que nos permite obter imagens de raster scanning as vigas em toda a amostra, similar ao comercial feixe de microscópios de varredura confocal. </li></ol> 2. O uso de três Curto Lasers Pulsada O uso de três resultados a curto lasers pulsados ​​na produção de vários sinais CARS, a partir do c váriasombinations de dois lasers, bem como 3-Color CARS e DR-FWM sinais a partir da combinação de todos os três lasers. <ol><li> Os comprimentos de onda dos sinais pode mentir espectralmente próximos uns dos outros. Quando os sinais estão juntos, pode ser difícil separá-las para análise, usando filtros de comprimento de onda fixo bandpass e espelhos dicróicos. Por esta razão, nossos sinais são transmitidos em um espectrômetro de imagem (2300i SpectraPro, Acton Research), que também serve como um monocromador eficiente para separar espacialmente sinais em diferentes comprimentos de onda. </li><li> Um espelho acionado eletronicamente virar dentro do espectrômetro na posição mais baixa envia o sinal para um retro-iluminado charge-coupled câmera do dispositivo esgotamento de profundidade (CCD), que fornece informações espectroscópicas em todo o alcance do sinal inteiro e permite-nos identificar e otimizar a coerente vários sinais Raman. </li><li> Para selecionar o sinal com o qual desejamos imagem que basta girar a grade dentro do espectrômetro, usando o fornecido pelo fornecedor de software de controle e aquisição de dados (WinSpec, Princeton Instruments), ao centro o pico de interesse na câmera CCD e altere a posição do espelho virar para redirecionar o sinal para uma porta de saída segundo a qual uma avalanche de contagem de fóton único foto-diodo (APD) foi anexado. </li><li> A lente objetiva é, então, raster-digitalizados e os sinais gravados na APD são usados ​​para gerar uma imagem, mostrando o fóton contam-rate para cada pixel através de dados de software de aquisição (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Alemanha). </li><li> Repetimos este procedimento para cada imagem desejada sinal coerente Raman, que nos permite comparar os sinais durante o pós-processamento. </li></ol> 3. Preparação da Amostra A fim de obter imagens nítidas e reprodutíveis alguns cuidados devem ser tomados na preparação da amostra. <ol><li> As amostras são geralmente preparadas em ~ 150 micron lamínulas de vidro de espessura. Estas lamelas são finos o suficiente para permitir imagens de alta resolução com o 1.2 Objectivos NA que são normalmente utilizados. </li><li> Captura óptica de objetos dielétrico pode ocorrer quando a luz do laser é difratado através de pequenos objetos transparentes. O uso de bem focada potência de pico, alto, curto feixes de laser pulsado pode então arrastar pequenas células ou bactérias junto, resultando em imagens borradas ou manchadas. , A fim de evitar isso, pode ser necessária para imobilizar a amostra na superfície da lamela de vidro pela primeira aplicação de uma fina camada de poli-L-lisina por revestimento rotacional. </li><li> Para células em cultura pratos de vidro de fundo a cultura pode ser utilizado para geração de imagens que permitem, sem a necessidade de separar as células do seu celular pratos de crescimento da cultura. </li><li> Para demonstração neste contribuição que primeiro depositar um C. formaldeído fixa elegans verme nematóide em uma lamínula de vidro. </li><li> Em seguida, adicione uma gota de 20 mL de solução de glicose 5 M deuterado para o worm. A solução de glicose deuterado oferece uma assinatura única de fundo e forte Raman. </li></ol> 4. Análise de amostra Por forma a podermos aproveitar o efeito de aumento duplamente os espectros Raman ressonante de ambas as substâncias Raman ressonante deve ser conhecido. <ol><li> Uma vez que a amostra é preparada na lamela é analisado usando um microscópio confocal Raman para a obtenção do espectro Raman espontâneo relevantes e identificar picos adequados. </li><li> Para executar DR-CARS que identificar os locais espectral do modo de estiramento CH, tipicamente associada com lipídios, eo modo de estiramento CD, associado com a glicose deuterado, a ser 2845 centímetros -1 e 2121 cm -1, respectivamente. </li><li> Espalhamento Raman coerente é alcançado quando a diferença de freqüência entre dois lasers coincide com a freqüência de uma vibração molecular. Pela OPO ajuste um a 817 nm que vai investigar a 2845 centímetros -1 modo de CH quando combinado com o feixe de laser 1064 nm e por meio do ajuste da OPO outros 868 nm vai investigar o pico de 2.121 centímetros -1 quando combinado com o feixe de 1064 nm . </li><li> Pela digitalização raster a amostra no microscópio CARS agora podemos observar três coerente sinais Raman de interesse. A CARS sinal de sondagem do CH alongamento vibração, um sinal de CARS sondando o modo de estiramento CD, e um sinal de DR-CARS sondagem ambos. </li><li> Nós selecionamos cada pico conforme descrito na Seção 2.3 e ter uma imagem como descrito acima. </li></ol> 5. Processamento de Imagem Extração de informações adicionais com base nessas três imagens agora requer algum processamento de imagem bastante simples. <ol><li> Primeiro as imagens devem ser normalizadas. Na normalização teoria pode ser alcançado pela contabilidade para a intensidade de cada laser envolvidos em cada processo de geração de sinal. Na prática, porém esta nem sempre funciona, principalmente devido à resposta espectral não uniformede espelhos dicróicos, detectores, e grades. </li><li> Um método prático para a normalização depende do fato de que em regiões onde lipídios pura dominam o sinal, a ressonância CD não deve contribuir para qualquer um dos sinais. Da mesma forma, em regiões de solução de glicose pura a ressonância CH não deve contribuir para qualquer um dos sinais. Com isto em mente, normalizar a imagem DR-CARS ea imagem CARS obtidos na ressonância CD da solução de glucose deuterado a uma região bem fora do C. elegans worm que deve apresentar nenhuma ressonância CH. </li><li> Então nós identificamos uma região dentro do worm na imagem CARS CH-ressonante que é rico em lipídios e normalizá-lo para a região correspondente na imagem DR-CARS normalizado. Para que esse método funcione corretamente, nós supor que no fundo esta região não deuterado glicose está presente. Esta é uma suposição segura desde que os lipídios são hidrofóbicos e não misturar com a solução. </li><li> Agora, subtraindo o normalizado CH-ressonante imagem CARS a partir da imagem DR-CARS normalizado ficamos com apenas o sinal amplificado CD-ressonante. </li><li> Da mesma forma, subtraindo o normalizado CD-ressonante imagem CARS a partir da imagem DR-FWM normalizado ficamos com apenas CH-ressonante do amplificado sinal. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Diagrama de DR-CARS sistema de microscopia como descrito acima. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: imagem de luz branca de um C. elegans verme em solução de glicose deuterado preparado em uma lamela de vidro e pronto para geração de imagens. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. Espectro Raman de ácido oléico modificados (um ácido graxo insaturado) que inclui uma modificação alcino (um carbono do grupo de carbono triple-bond) As ressonâncias CH forte em 2845 centímetros -1 ea ressonância alcino a 2100 cm -1 são ambos bem isolados da região de impressão digital (na região de picos densamente embalado), tornando-os marcadores ideal para imagens Raman coerente. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4:. Espectro típico de sinais coerentes Raman geradas quando três curtas-pulsado lasers são sobrepostas dentro da amostra As setas apontam para o processo (es) responsável por cada sinal representado por diagramas de energia. Nos diagramas mostrados aqui setas tracejadas indicam fótons do laser ea de OPO e setas sólidas indicam o sinal resultante. As linhas contínuas horizontais indicam a energia da vibração Raman e dar uma representação visual que, em DR-CARS, misturando os mesmos 3 fótons de entrada simultaneamente sondas dois diferentes vibrações Raman. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Os resultados típicos da imagem C. elegans worms usando DR-Carros e veículos. A linha superior usados ​​os três sinais indicados na Figura 4 para a imagem de um verme em uma solução de glicose deuterado. Na segunda linha as imagens foram devidamente normalizados e na terceira fila as imagens foram produzidas diferença, subtraindo cada uma das imagens CARS a partir da imagem DR-CARS.

<ol>
	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A espectroscopia Raman e Raman baseado em imagens são poderosas ferramentas emergentes nas ciências bio. Atualmente, isso é particularmente verdadeiro para o in vivo e in vitro do metabolismo celular e alterações metabólicas no processamento e armazenamento de lipídios. A maioria das bio-macromoléculas contêm um grande número de semelhantes, principalmente à base de carbono ligações moleculares, de modo que os espectros Raman obtidos a partir de células e organismos são tipicamente uma convolução de contribuições de lipídios, proteínas, ácidos nucléicos, açúcares, lipídios etc são relativamente fáceis para isolar a complexidade destes espectros, devido à sua tendência a formar gotas densas ou bicamadas e porque contêm longas cadeias com um grande número de ligações CH alifáticos. Nossa capacidade de isolar proteínas específicas, aminoácidos, RNA, DNA ou dentro do ambiente complexo celular é, no entanto, muito limitada. Isto é particularmente verdadeiro se estas moléculas de interesse só estão presentes em concentrações mM e abaixo. Aqui, a habilidade de sondar fraco ressonâncias Raman utilizando a nossa recém-introduzidas DR-CARS diferença técnica de imagem fornece uma abordagem potencialmente poderosas para o seu microanálise química e de imagem. É certo que a parte mais complicada deste protocolo é o alinhamento e sincronização do sistema de laser. Quando se inicia a partir do zero, a sincronização dos pulsos, ou seja, garantir que os pulsos são sobrepostos no tempo, apesar dos caminhos diferentes que toma pode ser facilitada pela utilização de um autocorrelador pulso. Sobreposição espacial e temporal, uma vez é atingido, CARS e DR-CARS sinais deve ser facilmente detectável. No entanto, o alinhamento do primeiro muitas vezes é bruto, resultando em sinais fracos. A melhor prática para alinhar este sistema também é inicialmente gerar sinais fracos e, em seguida, para melhorar a força do sinal suavemente ajustes dos espelhos ao longo de cada caminho e ajustar a sobreposição temporal utilizando as etapas atraso. Embora os atos espectrômetro / monocromador como um defletor muito eficiente para a luz ambiente o mais limpo resultados podem ser alcançados pela operação do sistema com as luzes da sala desligado e cortinas ou tubo de lente para minimizar fundo introduzidas pelas diversas outras fontes de luz (monitores de computador, por exemplo, luzes indicadoras, LEDs, etc.) Nossa configuração particular utiliza a contagem de fóton único avalanche foto-diodo (APD) e detectores de tempo de contagem de fótons correlacionados único (TCSPC) para detecção de hardware 5. Isso nos permite detectar sinais extremamente fracos com ruído relativamente baixo, mas muitos grupos têm encontrado foto multiplicador de tubos (PMT) com ganho variável vantajoso quando fazer medições semelhantes. A vantagem da PMT é que eles oferecem ganho variável e têm uma área de detecção muito maior que pode simplificar o alinhamento do detector. Além disso, a nossa configuração utiliza estágios piezo para traduzir o objetivo para alcançar Digitalização por feixe. A vantagem disso é que temos a capacidade de retornar para qualquer ponto dentro da imagem digitalizada anteriormente com um alto grau de precisão e tomar medidas adicionais, incluindo espectros Raman espontâneo. Outros grupos têm sido bem sucedidas montagens utilizando espelho de varredura, ou mesmo toda a unidades de varredura confocal, como o sistema FluoView Olympus, que oferece imagens muito mais rápido, mas é limitado em sua capacidade de retornar precisamente em locais arbitrários dentro de uma imagem. Ajustando o lasers para coincidir com a ressonância Raman também é um passo crítico que pode exigir alguma otimização. Embora os picos Raman podem ser conhecidas a intensidade máxima de pico espectral obtidos a partir de DR-Carros e veículos não corresponde necessariamente ao máximo do pico Raman espontâneo. Isto é devido à interferência intrínseca de sinais gerados por quatro ondas de mistura levando a um sinal de fundo não-ressonante e CARS, o que distorce CARS espectros relativos aos espectros Raman espontâneo. A localização espectral do pico do sinal CARS pode ser calculado, mas uma abordagem mais prática é para sintonizar a OPOS em vários pequenos passos espectrais em todo o local esperado da ressonância Raman. Este processo deve render um máximo claro. De fato, para a maior sensibilidade da DR-FWM tanto ressonâncias deve ser ajustado para esse valor máximo. Um último problema potencial da abordagem DR-CARS tem que ser discutido, ou seja, o sinal DR-CARS vai depender de uma distribuição homogênea da molécula Raman ativos ampliando. Para a maioria dos objetos biológicos, isso poderia muito bem ser a ressonância OH ampla da água, que é abundante e quase onipresente. A água é, no entanto, excluídos regiões hidrofóbicas com uma célula, como gotículas lipídicas, levando uma distorção dos sinais obtidos quando se utiliza a ressonância de água para amplificar os modos de lipídios. No nosso exemplo, usamos uma solução de glicose deuterado para gerar um sinal facilmente detectável e abundante para a nossa amostra biológica. Da mesma forma, deuterado água ou deuterado Buffe biológicars, tais como d-HEPES poderia ser usado. No nosso exemplo, o gotículas lipídicas dentro do C. elegans foram suficientemente pequeno para sempre contêm tanto, a solução de glicose e lipídios deuterado dentro do local de laser focalizado do nosso sistema. Isso, no entanto, geralmente não é verdade. Um exemplo particular seria adipócitos, que geram gotículas lipídicas dentro de seu bastante grande citoplasma. Isso significa que, qualquer experimento realizado com a técnica DR-CARS exige uma preparação cuidadosa e experimentos de controle para verificar os resultados.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

Coerente técnicas de imagem Raman ter visto um dramático aumento na atividade na última década devido à sua promessa de permitir rótulo sem imagem óptica com alta especificidade molecular 1. A sensibilidade destas técnicas, porém, é muitas ordens de grandeza mais fracas do que fluorescence, exigindo mili-molar 1,2 concentrações molecular. Aqui, descrevemos uma técnica que pode permitir a detecção de concentrações fracas ou baixas de Raman ativos moléculas, amplificando seu sinal aos obtidos com os fortes ou abundante dispersores Raman. A interação de curto lasers pulsados ​​em uma amostra biológica gera uma variedade de sinais coerentes espalhamento Raman, cada um dos que carregam informações sobre a química única amostra. Normalmente, apenas um destes sinais, por exemplo, Coherent Anti-Stokes Raman (CARS), é usado para gerar uma imagem, enquanto os outros são descartados. No entanto, quando estes sinais, incluindo 3 cores CARS e quatro ondas de mistura (FWM), são coletados e comparados com o sinal de CARS, caso contrário, difícil de detectar informação pode ser extraída 3. Por exemplo, carros duplamente ressonante (DR-CARS) é o resultado da interferência construtiva entre dois sinais de ressonância 4. Demonstramos como ajuste dos três lasers necessários para produzir DR-CARS sinais para o 2845 centímetros vibração estiramento CH -1 em lipídios e os 2120 centímetros vibração CD -1 estiramento de uma molécula deuterada (por exemplo, açúcares deuterado, ácidos graxos, etc) pode ser utilizado para ambas as ressonâncias sonda Raman simultaneamente. Sob essas condições, além de CARS sinais de cada ressonância, um sinal DR-CARS combinado sondagem ambos também é gerado. Demonstramos como detectar a diferença entre o sinal DR-CARS e amplificando o sinal de vibração de uma molécula abundante pode ser utilizada para aumentar a sensibilidade para o sinal mais fraco. Nós ainda demonstrar que essa abordagem se estende até mesmo para aplicações onde ambos os sinais são gerados a partir de moléculas diferentes, de tal forma que por exemplo, usando o sinal forte Raman de um solvente pode melhorar o sinal fraco Raman de um soluto diluído.

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Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados ​​é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.

Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

13.6K visualizações.  University of California, Davis. A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados ​​é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.

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Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Biologia

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recuperação de fluorescência após p62 fotobranqueamento de amarelo fluorescente proteína marcados em Aggresome induzida por estruturas

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

Radiografia de Nêutrons e Tomografia Computadorizada de Sistemas Biológicos no Reator de Isótopos de Alto Fluxo do Oak Ridge National Laboratory

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...