Este trabalho foi apoiado pelo NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT para LL

Os ratos foram criados e mantidos de acordo com os procedimentos padrão das instalações de animais, e todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Garantia de Assistência Animal e pelo Comitê Ético de Pesquisa em Animais interno de acordo com o Ministério da Saúde italiano e cumprido o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório. 1. Lesão muscular e o bloco In-Vivo de Fluxo Autofágico <ol><li> Lesão muscular. <ol><li> Para induzir uma lesão aguda do músculo esquelético, injete 20 μL de cardiotoxina 10 μM (CTX) diretamente no músculo tibial anterior anterior (TA) de ratos C57BL / 6J de 2 meses que pesam aproximadamente 20 g. Use um número igual de machos e fêmeas. Use o membro contralateral imperturbável como controle. NOTA: 10 μM de CTX em solução de cloreto de sódio a 0,9% devem ser filtrados (filtro PVDF de 0,22 μm) e armazenados a -20 ° C. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. </li><li> Usando um euSeringa nsulin com uma agulha de 30 G, injetar CTX no meio do TA. Para induzir uma lesão precisa no AT, assegure-se de que a agulha da seringa entre perto do tendão distal, com 5 mm de profundidade, do fundo para o topo do músculo ( Figura 1A ). </li></ol></li><li> Bloqueio do fluxo autofágico em ratos não perturbados e feridos. <ol><li> Para avaliar o fluxo autofágico, 24 h Post-Injury (pi), administre 50 mg / kg de cloroquina (CLQ) a cada 24 h durante 4 dias por injeção intraperitoneal (IP) ( Figura 1B ). <ol><li> Dissolve CLQ (10 mg / mL) em PBS 1X e filtre-a através de uma membrana de 0,2 μm. Pesar todos os ratos e calcular a quantidade de CLQ para injetar. NOTA: Prepare e use a solução CLQ no mesmo dia. O estoque CLQ pode ser armazenado por até um mês a -20 ° C. Uma vez que a autofagia é um processo relacionado ao metabolismo, sempre execute o tratamento CLQ sempre ao mesmo tempo (por exemplo, na manhã seguinteRe 10 AM). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Seções de tecido muscular <ol><li> Sacrifício do rato. <ol><li> Eutanizar os ratos 5 dias após a lesão. </li><li> Realize a eutanásia por luxação cervical ou por CO 2 (a seguir pela luxação cervical para confirmação). Uma vez que o processo de autofagia está relacionado aos hábitos de sono / alimentação do mouse, sempre sacrificar os ratos ao mesmo tempo, de preferência pela manhã ( ou seja, antes das 10:00 da manhã). </li></ol></li><li> Isolamento e inclusão de TA. <ol><li> Antes da dissecção, pulverize o mouse com etanol a 70%. </li><li> O uso de tesoura faz uma pequena e perpendicular incisão (3 mm de comprimento) na pele dorsal do mouse ao nível dos quadris. Corte a cauda e os pés para simplificar a remoção da pele. Puxe a pele para a cauda e remova-a para expor os músculos subjacentes; O músculo TA é fácil de localizar, como mostrado na Figura 2A </Forte&gt;. </li><li> Com a ajuda de duas fórceps, aperte os tendões distal. </li><li> Corte os tendões distal; Os tendões TA e extensor digitorium longus (EDL) são frequentemente cortados em conjunto e posteriormente separados (ver passo 2.2.6). </li><li> Usando fórceps, segure o músculo TA pelo tendão e puxe cuidadosamente o músculo para a extremidade proximal (perto do joelho, Figura 2B ). NOTA: Neste ponto, os músculos EDL e TA são facilmente reconhecíveis, sendo o TA maior e mais superficial do que o EDL. </li><li> Separe o TA do músculo EDL puxando os dois tendões distal nas direções opostas ( Figura 2C ). </li><li> Corte o tendão proximal. </li><li> Usando fórceps, remova a fáscia fina que cobre o músculo, sem danificar o tecido. </li><li> Remova a umidade excessiva na amostra com a ajuda de uma toalha de papel. Certifique-se de que o músculo não esteja nem molhado, nem excessivamente seco, pois a umidade excessiva produzirá sigDano significativo ao músculo e compromete a próxima coloração. </li><li> Coloque o composto Optimal Cutting Temperature (OCT) na parte inferior de um molde e coloque o músculo dentro dele, na orientação mostrada na Figura 2D . Adicione 100% de isopentano a um copo até atingir uma profundidade de aproximadamente 3-4 cm. Coloque o copo em contato com nitrogênio líquido em uma caixa de poliestireno. </li><li> Não deixe o nitrogênio líquido entrar no copo, pois produzirá uma espuma borbulhante, o que pode afetar a inclusão e danificar as seções musculares. </li><li> Observe o isopentano e aguarde até atingir a temperatura adequada (entre -140 ° C e -150 ° C); À temperatura apropriada, uma camada branca sólida de isopentano congelado cristaliza no fundo do copo. </li><li> Se o isopentano congelar completamente o sólido, derreta-o e esfrie até a temperatura de congelação antes de prosseguir para o próximo passo. </li><li> Usando fórceps pré-grelhados, delicadamente abaixe o molde emO isopentano por aproximadamente 20-30 s. Coloque a amostra congelada em um recipiente com gelo seco até que seja transferida para um congelador de -80 ° C. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. </li></ol></li><li> Criosecções de tecido muscular. <ol><li> Após pelo menos uma noite a -80 ° C, execute a criosecção. </li><li> Pegue a faca criostática e a placa anti-rolo do congelador de -20 ° C e coloque-os nos respectivos suportes no gabinete do criostato. </li><li> Coloque uma gota de OCT no talão da amostra e coloque sobre ela a amostra congelada, na orientação vertical NS, conforme visualizado na Figura 2D . </li><li> Coloque o talão de amostra no mandril. </li><li> Sem puxar o prato anti-rolo na faca, faça alguns cortes a 40 μm para se livrar de OCT que não inclui músculo. Quando o músculo se torna visível, reduza a espessura da fatia para 7-8 μm. </li><li> Puxe para baixo a placa anti-roll até ficar alinhada comA ponta da faca ou um pouco acima dela. </li><li> Corte as secções transversais de 7-8 μm de espessura e monte 3-4 fatias por lâmina histológica. NOTA: A temperatura sugerida do criostato está entre -15 ° C e -23 ° C. As secções transversais das amostras são necessárias para a análise subsequente para identificar as células-tronco muscular na posição de nicho do satélite. </li><li> Para maximizar a aderência da seção, mantenha as lâminas à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para evitar o seu desprendimento durante a incubação do anticorpo. NOTA: O passo de secagem ao ar pode afetar a imunocoloração, proporcionando resultados ambíguos. Os slides podem ser armazenados sem fixação por vários meses a -80 ° C. O protocolo pode ser pausado aqui. </li></ol></li><li> Verificando danos musculares em criosecções de músculos TA ao realizar a coloração com hematoxilina eosina (H &amp; E). <ol><li> Para avaliar a qualidade do músculo ( ou seja, a eficácia da lesão, isolamento muscular e inclusãoÍons e criosecções), realizam uma coloração H &amp; E. Para cada ponto de tempo experimental, conserte um slide com 4% de PFA por 10 min. Após a fixação, lave bem as corrediças em várias mudanças de 1x PBS. NOTA: Cuidado. O PFA é cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado. </li><li> Pegue um slide para cada ponto experimental e coloque-os em uma jarra de coloração. </li><li> Encha o frasco com hematoxilina 9 g / L até as secções serem cobertas e incubar durante 8 min. </li><li> Recicle a hematoxilina. </li><li> Deixe o frasco sob água corrente durante 10 minutos para remover o excesso de hematoxilina. NOTA: Certifique-se de não fluir a água diretamente para as seções. </li><li> Lavar com água esterilizada. </li><li> Incubar as secções com eosina 0,5% (p / v) em etanol a 90% acidificado durante 1 min. </li><li> Recicle a eosina. </li><li> Lave duas vezes com água estéril por 3 minutos / lavagem. NOTA: Execute as seguintes etapas em um capô químico. </li><li> Lave as secções com etanol a 70%. </li><li> lavarAs seções com 90% de etanol. </li><li> Lave as secções com 100% de etanol. </li><li> Incube as secções com 0,879 g / mL de o-Xileno. NOTA: Cuidado. O-Xileno é inflamável e moderadamente tóxico. Manipule-o sob uma capa química, usando equipamento de proteção, incluindo luvas, um bata de laboratório e uma máscara. </li><li> Recicle o o-Xileno. </li><li> Coloque as lâminas sobre um pedaço de papel para secar. </li><li> Feche os slides usando um meio de montagem com base em xileno rápido. </li><li> Verifique a qualidade das seções sob um microscópio óptico com ampliação de 10X (veja a Figura 3 ) NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. </li></ol></li></ol> 3. Imunomarcação para LC3 e MyoD em seções de tecido muscular ferido <ol><li> Fixação de seções de tecido muscular. <ol><li> Prepare uma câmara de incubação molhando um pedaço de papel e colocando-o no fundo de uma caixa de plástico fechável para manter um altoVelocidade de umidade dentro da câmara. Corrigir seções de tecido com 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS durante 10 min. NOTA: Um pedaço de papel molhado é usado para evitar a secagem da amostra. Prepare PFA fresco ou use PFA armazenado a -20 ° C. Cuidado. PFA é tóxico; O pó deve ser manuseado com cuidado ao fazer a solução de estoque. Esta operação deve ser realizada em um capô químico, com equipamento de proteção, incluindo luvas, um bata de laboratório e uma máscara. Além disso, quando em solução, o PFA deve ser manipulado com cuidado. </li><li> Remova o PFA e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3 vezes. </li></ol></li><li> Permeabilização de seções de tecido muscular. <ol><li> Desenhe uma barreira hidrofóbica em torno das seções de tecido usando uma caneta pap. NOTA: Este passo define a superfície ao redor das seções de tecido e minimiza o volume de anticorpos descritos nas etapas 3.4, 3.6, 3.7 e 3.9. </li><li> Cubra as secções com 200 μL de frio (-20 ° C)Metanol e coloque a câmara de incubação horizontalmente dentro de um congelador a -20 ° C durante 5 min. </li><li> Retire a câmara de incubação do congelador, aspirar o metanol e lave as secções com 1X PBS durante 5-7 minutos à TA; Repita este passo 3x. </li></ol></li><li> Bloqueio <ol><li> Prepare uma solução de bloco fresco de 4% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS 1x. NOTA: A solução BSA pode ser armazenada durante 1 semana a 4 ° C. </li><li> Incube as secções com solução de bloqueio durante pelo menos 60 minutos à RT. </li><li> Remova a solução de bloqueio. </li><li> Prepare 100 μL de mistura anti-Fab diluyendo 20 μg / mL anti-Fab em 1x PBS. Incubar as secções com um fragmento F (ab) purificado por afinidade não conjugado de IgG anti-ratinho durante 1 h à TA. </li></ol></li><li> Incubação primária de anticorpos. <ol><li> Prepare 100 μL de mistura primária de anticorpos para cada lâmina, dissolvendo os anticorpos LC3 e MyoD em 4% de BSA em 1x PBS. Use 5 μg /ML de anti-LC3 (anticorpo policlonal de coelho) e 10 mg / L de anti-MyoD (anticorpo monoclonal de rato). Incubar a mistura primária de anticorpos durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavagens. <ol><li> Remova a mistura primária de anticorpos. </li><li> Lavar as secções com 1% de BSA em 1X PBS durante 10 min; Repita este passo 3x. </li></ol></li><li> Incubação secundária de anticorpos. <ol><li> Prepare 100 μL de mistura de anticorpos secundários para cada lâmina. Dissolver 488 de cabra anti-coelho (5 μg / mL) e 594 de cabra anti-ratinho (5 μg / mL) em BSA a 4% em 1x PBS. NOTA: Evite a exposição excessiva à luz para evitar o branqueamento com fluorochrome. Execute as seguintes etapas no escuro. </li><li> Incubar as secções com a mistura de anticorpos secundário durante 45 minutos à TA. </li><li> Remova a mistura de anticorpos secundários e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x. </li></ol></li><li> Incubação primária de anticorpos. <ol><li> Diluir laminiAnticorpo monoclonal n-2 (cadeia α-2) (0,33 μg / mL) em BSA a 4% em 1x PBS usando 100 μL de mistura para cada slide. Incubar as secções na mistura de anticorpos primários durante 1-2 h à TA. </li></ol></li><li> Lavagens. <ol><li> Remova a mistura primária de anticorpos. </li><li> Lavar as secções com 1% de BSA em 1X PBS durante 10 min; Repita este passo 3x. </li></ol></li><li> Incubação secundária de anticorpos. <ol><li> Prepare 100 μL de mistura de anticorpos secundários para cada lâmina diluyendo 647 de cabra anti-rato (5 μg / mL) em BSA a 4% em PBS 1X. Incubar as secções na mistura de anticorpos secundários durante 45 minutos à TA. </li><li> Remova a mistura de anticorpos secundários e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x. </li></ol></li><li> 4 &#39;, 6-Diamidino-2-fenilindole (DAPI). <ol><li> Adicione 200 μL de solução de DAPI 300 nM em 1x PBS a cada slide. Incubar durante 5 min à TA. Armazene a solução DAPI a 4 ° C noSombrio. </li><li> Lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x. </li></ol></li><li> Montagem de seções musculares coradas. <ol><li> Remova o excesso de solução de lavagem das seções. </li><li> Coloque 10 μL de glicerol em 1x PBS (3: 1) nas secções coradas no meio do slide e adicione um lamínula, evitando a formação de bolhas de ar. </li></ol></li></ol> 4. Aquisição de microscopia confocal <ol><li> Adquira as imagens usando um microscópio confocal de quatro laser integrado com um sistema de captura de imagem e software analítico. NOTA: MyoD é conjugado com um corante 594 que é um corante fluorescente vermelho brilhante, com excitação ideal para o laser de 594 nm (excitação: 590 nm, emissão: 617 nm). LC3 é conjugado com um corante 488 que é um corante fluorescente verde brilhante, com excitação ideal para a linha laser de 488 nm (excitação: 495 nm, emissão: 519 nm). Laminin é conjugado com um corante 647 que éUm corante brilhante fluorescente far-vermelho, com excitação ideal para a linha a laser de 647 nm (excitação: 650 nm, emissão: 668 nm). </li><li> Coloque os slides na bandeja do microscópio e use a ampliação 63X para detectar sinais nucleares. Concentre-se manualmente nas áreas regenerativas centrando os campos de regeneração ativa, confiando na morfologia muscular (veja a Figura 4 ). NOTA: Enquanto o músculo não perturbado, o tamanho da miofibra é praticamente constante ( Figura 4A ), a regeneração muscular mediada por lesões pode ser reconhecida pela aparência de miofibras menores, que são as fibras recém formadas após a regeneração. Além disso, o músculo na regeneração ativa é caracterizado por um extenso infiltrado que é feito de macrófagos, precursores fibro-adipogênicos e células que estão localizados nos músculos danificados para orquestrar a regeneração muscular ( Figura 4B ). </li><li> Avaliar a coloração imunofluorescente em regenOcupando áreas focadas em MuSCs que estão localizados sob a lâmina basal das miofibras. </li><li> Concentre-se em MuSCs que são positivos para a coloração MyoD e posicionados dentro das miofibras marcadas pela coloração de laminina (ver Figura 4B , setas brancas). </li><li> Use pelo menos 3 ratos / grupo experimental e use o microscópio para adquirir imagens de ampliação 63X de pelo menos 7 campos para cada grupo experimental. </li><li> Uma vez identificadas as áreas regenerativas, concentre-se na coloração DAPI e, em seguida, ajuste os outros canais individuais. <ol><li> Use as seguintes configurações de microscópio: Canal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Canal A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Canal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719. </li></ol></li><li> Depois de ajustar o foco dos canais individuais, proceda a adquirir as imagens com um tamanho de quadro de 1.024 x 1.024 e uma ocupação de pixels de 12,61 μs. </li><li> Contagem da porcentagem de células MyoD-positivas (controle para tEle correta localização sob a lâmina) que são LC3-negativos e a porcentagem de células MyoD-positivas que exibem um sinal LC3. NOTA: A porcentagem de células positivas para MyoD que exibem coloração LC3 é a leitura deste protocolo. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+TRAF6+at+early+and+late+stages+of+muscle+pathology+in+the+mdx+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).</li><li>Pauly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+activation+stimulates+autophagy+and+ameliorates+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse+diaphragm.">AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm.</a> Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).</li><li>Spitali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+Impaired+in+the+Tibialis+Anterior+of+Dystrophin+Null+Mice.">Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice.</a> PLoS Curr. 5, (2013).</li><li>Whitehead, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autophagy+as+a+potential+mechanism+for+the+improved+physiological+function+by+simvastatin+in+muscular+dystrophy.">Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy.</a> Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).</li><li>Whitehead, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+therapeutic+effect+of+simvastatin+revealed+by+functional+improvement+in+muscular+dystrophy.">A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).</li><li>Fiacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+regulates+satellite+cell+ability+to+regenerate+normal+and+dystrophic+muscles.">Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles.</a> Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).</li><li>Lee, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+NAD-dependent+deacetylase+Sirt1+in+the+regulation+of+autophagy.">A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).</li><li>Rubinsztein, D. C., Mari&#241;o, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging.">Autophagy and aging.</a> Cell. 146 (5), 682-695 (2011).</li><li>Colman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+delays+disease+onset+and+mortality+in+rhesus+monkeys.">Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys.</a> Science. 325 (5937), 201-204 (2009).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132 (1), 27-42 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Calorie+Restriction+Enhances+Cellular+Quality-Control+Processes+in+Human+Skeletal+Muscle.">Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).</li><li>Wenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+muscle+PGC-1alpha+expression+protects+from+sarcopenia+and+metabolic+disease+during+aging.">Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).</li><li>Carnio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Impairment+in+Muscle+Induces+Neuromuscular+Junction+Degeneration+and+Precocious+Aging.">Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Sandri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misregulation+of+autophagy+and+protein+degradation+systems+in+myopathies+and+muscular+dystrophies.">Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).</li><li>Cerletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+calorie+restriction+enhances+skeletal+muscle+stem+cell+function.">Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).</li><li>Gopinath, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3+promotes+quiescence+in+adult+muscle+stem+cells+during+the+process+of+self-renewal.">FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).</li><li>Tang, A. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+supports+the+bioenergetic+demands+of+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.</a> EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+maintains+stemness+by+preventing+senescence.">Autophagy maintains stemness by preventing senescence.</a> Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar

<html> Este protocolo descreve como monitorar a autofagia nas células-tronco do músculo esquelético durante a regeneração muscular compensatória. Vários anticorpos para co-coloração de LC3 e MyoD foram testados, e aqueles que trabalham em seções de tecido de mouse e criam resultados bem-sucedidos estão listados aqui (ver Tabela de Materiais ). A permeabilização com metanol (ver passo 3.2.2) é altamente recomendável para coloração bem sucedida. A limitação ...

A regeneração muscular esquelética é o resultado da interação entre células estaminais adultas (células musculares de músculo, MuSCs) e outros tipos de células envolvidas no processo regenerativo. A homeostase muscular e a funcionalidade são mantidas pelos sinais combinados decorrentes do nicho muscular e das indicações sistêmicas 1 , 2 . Ao longo da vida, foram relatadas mudanças na funcionalidade MuSC, no nicho muscular e nas pistas sistêmicas, levando ao declínio das capacidades funcionais nos idosos 3 . Os MuSCs são definidos em um nicho abaixo da lâmina basal e, após lesão muscular, são ativados para reparar os músculos danificados 4 , 5 . Para garantir uma resposta regenerativa produtiva, é crucial que os MuSCs coordenem os diferentes processos necessários para a saída da quiescência, a auto-renovação e o estágio de expansão proliferativa seguiramPela diferenciação miogênica 6 . Nos idosos e nas doenças crônicas musculares, todas essas funções são comprometidas, levando a funcionalidades musculares alteradas 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . A macroautofagia (referida a seguir como autofagia) está emergindo como um processo biológico crucial essencial para preservar a homeostase dos tecidos 14 . O processo autofágico inclui mecanismos de tráfico, em que partes de citoplasma, organelas e proteínas são engrossadas em vesículas que eventualmente são degradadas através da via do lisossoma, promovendo a remoção de moléculas tóxicas e a reciclagem de macromoleCules. Isso fornece compostos ricos em energia para apoiar a adaptação das células e tecidos sob estresse ou outras condições adversas 15 , 16 . Juntamente com a sua atividade de sobrevivência celular, a autofagia também pode funcionar como indutor de morte celular, dependendo do contexto do tecido celular ( por exemplo, tecido normal versus câncer) e do tipo de estímulo de estresse 17 , 18 . Evidências recentes indicam que a autofagia é necessária para manter a massa muscular e a integridade da miofibra 19 , 20 e foi relatada como prejudicada em diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluindo a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP&gt; , 28 , 29 , 30. Da mesma forma, uma redução progressiva do processo autofágico foi observada nos idosos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , após perda de massa muscular (referida como sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e na sobrevivência de miofibra 38 . Uma relação estreita entre a autofagia e o potencial regenerativo dos músculos esqueléticos foi antecipada por um estudo do laboratório de Wagers, que mostrou que uma restrição calórica aumenta a disponibilidade e a atividade de MuSC 39 . Isso nãoFoi ainda apoiada pela recente observação de que o eixo Foxo3-Notch ativa o processo autofágico durante a auto-renovação 40 e a transição MuSC do estado quiescente para o estado proliferativo 41 . Esses dados concordam com a redução progressiva da autofagia basal de MuSCs jovens e antigos e geriátricos, em associação com o declínio numérico e funcional de MuSCs durante o envelhecimento 42 . Em um artigo recente, demonstramos uma estreita relação entre a autofagia e a regeneração muscular compensatória que distingue os estágios iniciais da progressão da DMD. Consequentemente, observamos um fluxo autofágico reduzido nos estágios posteriores da progressão da doença, quando a regeneração muscular é comprometida e a deposição de tecido fibrótico ocorre. Intrigantemente, mostramos que, em condições de regeneração, a autofagia é ativada nos MuSCs e que a modulação do processo autofágico afeta a ativação MuSC e o fuNação universal 30 . No total, esses dados destacam a urgência de explorar o processo autofágico em MuSCs durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas e ao longo da vida. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico em MuSCs nas condições regenerativas musculares, realizando imunocoloração in situ para proteína 1A / 1B-cadeia leve 3 (LC3) associada a microtúbulos, um marcador de autofagia 43 e MyoD, um marcador de Linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o MuSC, que desempenha um papel fundamental na orquesta da regeneração muscular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:332px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:251px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:128px;">000664</td>
			<td style="width:196px;">WT mice</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cardiotoxin 1</td>
			<td>Latoxan</td>
			<td>L8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Millex-VV</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td style="width:196px;">Syringe Filter Unit, 0.1 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Chloroquine diphosphate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">BD Micro-Fine + 0,5 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-Methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:122px;">o-Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1040</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td style="width:196px;">Caution: 
			Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Eukitt - Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LC3B Antibody</td>
			<td>Cell signaling Technology</td>
			<td>2775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:332px;">Monoclonal mouse anti-MyoD 
			(concentrated) clone 5.8A</td>
			<td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td>
			<td>M3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Laminin-2 (&#945;-2-chain) monoclonal antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>4H8-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody</td>
			<td style="width:251px;">Life technologies</td>
			<td style="width:128px;">A21248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:332px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells

O aumento da evidência aponta para a autofagia como um processo regulatório crucial para preservar a homeostase do tecido. Sabe-se que a autofagia está envolvida no desenvolvimento e regeneração do músculo esquelético, e o processo autofágico foi descrito em várias patologias musculares e distúrbios musculares relacionados à idade. Um bloco recentemente descrito do processo autofágico que se correlaciona com o esgotamento funcional das células satélites durante o reparo muscular reúne a noção de que a autofagia ativa é acoplada à regeneração muscular produtiva. Estes dados revelam o papel crucial da autofagia na ativação das células satélites durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas, como distrofias musculares. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico no compartimento adulto da célula tronco muscular (MuSC) durante as condições regenerativas musculares. Este protocolo descreve a metodologia de instalação para realizar a imunofluorescência in situ de LC3, umaMarcador de utofagy e MyoD, um marcador de linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o compartimento MuSC, que desempenha um papel central na orquestação da regeneração muscular.

Este protocolo descreve um método in situ eficiente para detectar autofagia em MuSCs durante a regeneração muscular. Tratamentos CTX In Vivo : Use CTX para induzir danos musculares nos músculos TA e use músculos não perturbados como controles. Uma vez que a autofagia é altamente dinâmica, bloqueie o fluxo autofágico realizando injeções IP d...

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In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

10.1K visualizações.  Italian National Research Council.  A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. 

Vídeo: In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Biologia

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos<em&gt; Ex vivo</em&gt; E músculo tibial anterior<em&gt; Em situ</em&gt; Em Ratos

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...