A avaliação dos perfis moleculares nos tecidos locais é um passo crítico para a compreensão do mecanismo de ação dos fármacos ativos, pois são avaliados em modelos pré-clínicos relevantes para a doença. No campo da pesquisa da artrite, o ambiente de interesse do tecido local são as pequenas articulações de peso que são compostas por uma mistura complexa de células ósseas, cartilagem, muscular e imune. Aqui descrevemos um método robusto confiável para a interrupção mecânica e/ou pulverização deste complexo ambiente tecidual em um ambiente criogenicamente controlado.
Este método pode então ser usado para gerar esforços de perfil proteômico e transcricional a jusante para estabelecer assinaturas moleculares da doença a partir de uma única fonte de amostra uniforme. Este método gera um pó homogêneo ao contrário de muitas outras técnicas antigas. Além disso, o antigo procedimento de isolamento de temperatura permite o isolamento do RNA de alta qualidade.
Este método pode então ser usado para gerar perfis proteômicos e transcricionais a jusante, permitindo a caracterização molecular de caminhos de interesse relevantes da doença. Este método pode fornecer insights para qualquer campo de pesquisa que esteja derivando assinaturas moleculares de tecidos. O método poderia ser estendido a qualquer sistema tecidual complexo que tenha densos e difíceis de dissociar constituintes.
Embora não tenhamos avaliado até agora, pudemos ver a aplicação potencial de tecidos de cartilagem densas como orelhas ou ossos. A natureza crítica do tempo de transferir o pó para tubos para pesagem é algo que requer prática. Se muito tempo for levado, o pó começará a descongelar e se tornar amorfo.
É importante limitar o número de amostras para 10 a 15 até que você esteja confortável com o procedimento. No dia do processamento tecidual, todos os instrumentos necessários em gelo seco durante o mínimo de 10 minutos. Use luvas térmicas para evitar ser prejudicado pelo frio extremo.
Em seguida, transfira cada uma das patas de rato preparadas para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro e imediatamente encaixe o congelamento em nitrogênio líquido. Guarde as patas congeladas a 80 graus Celsius negativos. Quando estiver pronto para continuar, encha um moinho de congelador com nitrogênio líquido e deixe equilibrar por pelo menos 10 minutos.
Coloque a amostra não processada em gelo seco e mantenha-a lá para evitar ciclos de congelamento/degelo. Em seguida, transfira uma pata traseira em um frasco de moagem de policarbonato grande pré-refrigerado com um plugue de aço inferior. Insira o impactor de aço pré-refrigerado e feche o frasco de moagem de policarbonato com o plugue de aço superior pré-refrigerado.
Transfira os frascos de moagem de policarbonato grandes com as amostras para o moinho de congelador pré-preenchido e feche a tampa com o fecho de borracha encontrado na frente do instrumento. Deixe as amostras esfriarem no nitrogênio líquido por um minuto. Em seguida, coloque o moinho de congelador no programa de um minuto com 10 ciclos por segundo.
Pressione o botão de execução e aguarde que o moinho de congelador complete seu ciclo. Depois disso, abra a tampa do moinho de congelador e tire o frasco de moagem de policarbonato grande. Coloque o frasco de moagem em um extrator e remova o plugue de aço superior colocando pressão para baixo na alça preta até que o plugue de aço deslize para fora do tubo de policarbonato.
Transfira o frasco de moagem aberto para gelo seco e use fórceps pré-refrigerados para remover o impactor de aço. Transfira o pó congelado para um tubo cônico pré-refrigerado de 50 mililitros. Pesar entre 30 e 50 miligramas do pó congelado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro hierárquico para extração de RNA e entre 100 e 200 miligramas para extração de proteínas.
Armazene as amostras pulverizadas a 80 graus Celsius negativos e prossiga para isolamentos de RNA e proteínas dentro de 24 horas. Primeiro, adicione 10 microliters de beta-mercaptoetanol para cada mililitro de buffer RLT. Calcule o volume do tampão RLT correspondente a uma razão de 23,3 mililitros por miligrama de tecido e adicione o volume apropriado de tampão RLT com beta-mercaptoetanol ao tubo com pó congelado.
Vórtice a amostra a 3.000 RPM por 10 segundos. Use uma pipetter de um mililitro para pipeta para cima e para baixo vigorosamente 10 vezes e vórtice da amostra novamente a 3.000 RPM por 20 segundos. Centrifugar a 13.000 vezes g por dois minutos e transferir 700 microliters do supernante para um tubo fresco.
Adicione 700 microliters de 70% de etanol a este tubo e carregue 700 microliters da amostra em uma coluna de purificação de RNA. Centrifugar o tubo a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g durante 30 segundos. Descarte o fluxo e carregue a parte restante da amostra na coluna RNeasy e centrifugar o tubo novamente a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g durante 30 segundos.
Descarte o fluxo e lave a coluna adicionando 700 microliters de tampão RW1 e centrifugando pelo menos a velocidade de 10.000 vezes g por 30 segundos. Se realizar a digestão DNAse opção, 350 microliters de RW1 são adicionados antes do tratamento DNAse. E após o tratamento DNAse, mais 350 microliters de RW1 são adicionados.
Em seguida, lave a coluna duas vezes adicionando 500 microliters de tampão RPE e centrífuga a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g por 30 segundos certificando-se de descartar o fluxo de cada vez. Depois disso, seque a coluna centrifugando-a a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g por dois minutos. Elute o RNA adicionando 50 microliters de água e centrifugando a uma velocidade de pelo menos 10.000 vezes g por dois minutos.
Colete o fluxo e transfira-o para um novo tubo de 1,5 mililitro. Determine a quantidade de RNA usando o método de escolha do pesquisador e armazene a 80 graus Celsius negativos antes de uma análise mais aprofundada. Diluir a solução de estoque de lise celular 10X para a solução de estoque de lise celular 1X com água de grau de cultura celular.
Reconstituir o coquetel inibidor de protease definir um com um mililitro de água para fazer um estoque inibidor de protease 100X. Adicione 100 mililitros de inibidor de protease a 9,9 mililitros de tampão de lise celular 1X para obter uma solução de estoque final 1X. Adicione quatro microliters de tampão de lise celular fria para cada miligrama de pó de tecido e adicione uma conta de aço inoxidável de cinco milímetros ao tubo.
Vórtice o tubo a 3.000 RPM por 60 segundos. Transfira o tubo para o gelo molhado e continue para a próxima amostra. Além disso, os pesquisadores podem descobrir que colocar a caixa vertical pode facilitar uma melhor mistura com a conta.
Após uma hora, centrifufique os tubos a 10.000 vezes g e a 4 graus Celsius por 15 minutos. Transfira os supernantes para um tubo fresco, certificando-se de evitar a camada de gordura na parte superior. Determine a concentração total de proteínas.
Alíquotar cada amostra em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mililitro e armazená-los a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para realizar uma análise mais aprofundada. Neste estudo, um método de pulverização criogênica é usado para processar patas murinas, a fim de melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a respostas inflamatórias. Uma visualização representativa de imagem em gel mostra o RNA extraído das patas dianteiras dos ratos da CIA.
As bandas de rRNA 28S e 18S indicam que todas as amostras têm quantidade suficiente de RNA intacto. Um gráfico representativo das concentrações totais de proteínas baseadas na análise de BCA proteica é mostrado aqui. Concentrações totais de proteínas de camundongos ingênuos, camundongos da CIA ou camundongos da CIA sob vários tratamentos são comparáveis entre grupos.
As análises luminex são então conduzidas para determinar as concentrações de citocinas inflamatórias e quimiocinas no extrato de proteínas. Um gráfico representativo das concentrações de citocinas e quimioterapias normalizadas revela que, quando comparados com camundongos ingênuos, várias citocinas são elevadas em camundongos da CIA e o tratamento com anticorpo anti-IL17A inibe significativamente a produção de várias citocinas. A análise da microarray é realizada para avaliar as alterações de transcriptome na CIA e efeitos relacionados ao tratamento.
Um gráfico representativo do mapa de calor de genes aumentou significativamente em camundongos da CIA em comparação com ratos ingênuos é mostrado aqui. Ao realizar esse procedimento, é fundamental que os pesquisadores minimizem o tempo em que o tubo e o pó são mantidos fora do gelo seco. Isso ajuda a evitar o descongelamento do pó e problemas subsequentes ao RNA degradado e à proteína.
A alta qualidade das assinaturas moleculares geradas por essa técnica permite aos pesquisadores interrogar o perfil único que um terapêutico irá transmitir e ainda permite a diferenciação de mecanismos que podem ser utilizados para tratar condições artríticas. Esta técnica poderia ser usada para extrair uma série de tecidos densos como orelhas e ossos para avaliar ainda mais assinaturas moleculares nesses tecidos de interesse. Entender como a terapêutica modula as assinaturas moleculares da doença nos permite avaliar melhor quais caminhos específicos de sinalização são modulados.
E talvez ainda mais importante, quais caminhos não são regulados com o mecanismo terapêutico sendo avaliado. Ao trabalhar com nitrogênio líquido e gelo seco, é imprescindível usar equipamentos de proteção individual, incluindo luvas devidamente avaliadas e escudos faciais. A exposição da pele por mais de alguns segundos pode causar queimaduras graves.
Ao trabalhar com grandes quantidades de gelo seco, é importante trabalhar em uma área bem ventilada, pois o gelo seco libera dióxido de carbono.
