Nosso protocolo aborda uma necessidade não atendida de um método robusto e reprodutível para análise quantitativa de mudanças articulares no desenvolvimento e progressão da osteoartrite. Nossa técnica traça parâmetros específicos e reprodutíveis para a análise quantitativa de alterações em múltiplos tecidos articulares na osteoartrite. Como essa técnica permite a análise quantitativa da osteoartrite, pode ser empregada para comparar os efeitos de tratamentos específicos em múltiplos tecidos articulares, a fim de avaliar sua eficácia terapêutica.
Nosso protocolo também pode ser aplicado a outros modelos de osteoartrite ou áreas de pesquisa musculoesquelético em que a quantificação da cartilagem e osso é necessária. Embora o sistema seja simples e intuitivo, as sessões de treinamento ainda são necessárias para praticar a obtenção de medições de forma repetida para alcançar a reprodutibilidade. Vengadeshprabhu Karuppagounder, um estudioso de pós-doutorado do nosso laboratório, agora estará demonstrando nosso procedimento.
Comece ligando o microscópio, câmera, computador e monitor de tela sensível ao toque. Selecione o objetivo 4X e clique no ícone de software para iniciar o programa de software. Coloque o slide no estágio do microscópio e centralizar a amostra dentro da janela de medição garantindo que a grade de medição seja definida para a ampliação adequada para corresponder ao objetivo, na medida em que tanto a superfície articular tibial quanto o osso subcondral tibial estão incluídos nas regiões de interesse da imagem.
Em seguida, no menu Arquivo, selecione "Ler configurações". Na janela Configurações, selecione o arquivo de configurações apropriado para que os parâmetros sejam medidos. Para medir a área total da cartilagem, selecione a função Tib TC e rastreie ao longo da borda superior da superfície da cartilagem tibial onde a cartilagem encontra o espaço articular e ao longo da junção condro-osseosa onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral.
Para medir a área de cartilagem calcificada selecione a função Tib CC e trace uma linha ao longo da marca da maré, uma linha natural que separa as regiões calcificadas e não calcificadas da cartilagem, e ao longo da junção condro-ósseo onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral. Para determinar a área de cartilagem não calcificada, subtraia a área de cartilagem calcificada da área total da cartilagem. Para determinar o número de condrocitos, crie funções de contagem separadas dentro das configurações do software histomorfometria para distinguir os condrocitos de produção de matriz e matriz que não produzem.
Em seguida, use a caneta para fazer um pequeno ponto sobre cada condrocito expressando o fenótipo especificado para determinar o número de matrizs produzindo ou não produzindo condrocitos. Para medir o parâmetro total da superfície articular tibial, rastreie uma linha através da superfície da cartilagem tibial para definir cuidadosamente as fibrilações individuais. Em seguida, desenhe uma segunda linha ao longo da marca da maré para servir como um controle interno para o plano de cada seção e divida o parâmetro de superfície articular tibial pelo parâmetro da marca da maré para calcular o índice de fibrilação da superfície articular tibial.
Para medir a área de espaço de medula subcondral, selecione a função Área da Medula. Em seguida, desenhe linhas ao redor do parâmetro dessas áreas para determinar a área total do espaço da medula óssea dentro do osso subcondral tibial. Para medir a área subcondral total, selecione a função óssea subcondral e delineie a região entre a junção condro-osseosa na borda superior da placa de crescimento que se estende lateralmente às regiões dos osteófitos anteriores e posteriores.
Em seguida, subtraia a área de espaço de medula óssea subcondral da área subcondral total para calcular a área óssea subcondral. Para medir a área de osteofita, selecione a função de osteofitto anterior e rastreie o osteofitfise anterior da tíbia proximal. Em seguida, selecione o osteofite posterior e rastreie o osteofite posterior da tíbia proximal.
Para medir a espessura sinovial femoral anterior, clique no Anterior Femur Synovium Meniscus e desenhe uma linha do ponto de inserção interna do sinolio anterior no fêmur em direção ao seu ponto de fixação no menisco e uma linha da inserção externa do sintédio no fêmur em direção ao seu apego ao menisco. Em seguida, divida a área sinovial total pelo parâmetro sinovial para calcular a espessura sinovial. A osteoartrite induzida por DMM resulta em um aumento da pontuação da Osteoartrite Research Society International em comparação com camundongos falsos.
Distintamente caracterizado pela erosão superficial e cartilagem perdida. Este protocolo de histomorfometria pode ser usado para detectar várias alterações associadas à osteoartrite, incluindo uma diminuição na cartilagem total e áreas de cartilagem não calcificadas. Redução do número total de condrocitos e, importante, perda no número de condrócitos produtores matricial.
Alterações na superfície articular, indicativas da gravidade da erosão, também são observadas, incluindo um aumento global do índice de fibrilação. A osteoartrite também inclui um aumento na área óssea subcondral e uma redução na área do espaço de medula óssea em camundongos DMM indicando esclerose óssea subcondral. As áreas de osteofito anterior e posterior também aumentaram em camundongos DMM, sugerindo uma remodelagem óssea subcondral contínua que atua como um mecanismo compensatório para lidar com mudanças no carregamento articular no local da lesão.
A análise histomorfométrica do sinodolio mostra um aumento na espessura sinovial em camundongos DMM. Um resultado típico da osteoartrite associado à inflamação sinovial e à difusão de citocinas inflamatórias no espaço articular. Além disso, não é observada variabilidade significativa entre os histomorphométricos da área de cartilagem não calcificada no escore da Osteoartrite Research Society International.
Após análise histomorfométrica, slides sequenciais e coloração de imunofluorescência podem ser usados para examinar alterações na expressão proteica entre as amostras.
