A técnica de gravação de banho foi usado pela primeira vez por Fricke (1984) 8 e Beall et al. (1990) 9 para medir campos elétricos gerados durante tail-flips. A técnica foi posteriormente modificado e melhorado no laboratório do Dr. Donald Edwards (Georgia State University) por seu ex-aluno de pós-graduação Dr. Fadi Issa A. e sua ex-associado postdoctoral Dr. Jens Herberholz. Aperfeiçoamentos foram feitos e aplicações novas pesquisas foram testados no laboratório do Dr. Jens Herberholz da Universidade de Maryland. Gostaria de agradecer ao meu colega Dr. David Yager por me deixar usar seu sistema de vídeo de alta velocidade e os meus assistentes de pesquisa e William David Rotstein Liden para a ajuda com os experimentos.

Parte 1: Câmara de gravação <ol><li> A câmara de gravação é de forma retangular e é feito de vidro com paredes finas. Câmara dimensões são 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (comprimento x largura x altura) para animais de 2,5-3,5 centímetros comprimentos total (medido a partir rostro até telson). Ver fig. 1 para um exemplo de uma câmara utilizada em nossos experimentos. </li><li> Alternativamente, as câmaras de gravação pode ser feita a partir de outros materiais (por exemplo, de plástico atóxico transparente). Chambers tamanho pode variar de acordo com o procedimento experimental e câmaras deve ser personalizado para cada série experimental. Para melhores resultados, tamanho da câmara deve ser tão pequena quanto possível, sem restringir os animais em seu comportamento natural. Como regra geral, os comprimentos e largura da câmara não deve ser superior a três vezes o tamanho do animal. </li></ol> Parte 2: eletrodos Bath e fio terra <ol><li> Um par de eletrodos de registro e um eletrodo terra são utilizados. Eletrodos são feitos de fio de cobre isolado (26 AWG com isolamento 0,25 mm). Uma das extremidades dos eletrodos banho é conectado a um amplificador extracelular (AM Sistemas de 1700; veja abaixo) e 0,5-1,0 mm de isolamento são tirou a outros fins. O fio terra está ligado ao aterramento do amplificador ou qualquer outro equipamento aterrado e 2-3 cm de isolamento é retirada do outro lado. </li><li> Eletrodos de banho e fio-terra são presos às paredes interior da câmara gravando com cola não tóxica. Eletrodos de registro são posicionados centralmente em ambos os lados curtos da câmara e em frente ao outro (Fig. 1). </li><li> Eletrodo terra está posicionado em um lado comprido da câmara de gravação perpendicular aos eletrodos de gravação (Fig. 1). </li><li> Câmara está cheia com água deionizada. Melhores resultados são obtidos com água de alta resistência (~ 18 mohms). </li></ol> Parte 3: gravações eletrodo Bath <ol><li> Saídas de eletrodos de registro são amplificados (1000x) por um amplificador extracelular (AM Sistemas; Modelo 1700). Sinal do eletrodos de registro é filtrado usando uma combinação de baixa freqüência (&lt;100 Hz) e alta freqüência de corte (&gt; 5 kHz). Sinal é então ligado a uma caixa de comutação e uma placa de aquisição de dados (National Instruments). Dados digitalizados é gravado, armazenados e analisados ​​utilizando dados de aquisição de software (Ferramentas Photron Motion). </li><li> Alternativamente, o sinal amplificado a partir de eletrodos de registro pode ser digitalizado usando outros conversores analógico-digital (por exemplo, MDS Analytical Technologies; Digidata 1440) antes que os dados digitalizada é gravados com software de aquisição de outros comercialmente disponíveis dados (por exemplo, MDS Analytical Technologies; Axoscope). </li></ol> Parte 4: Estimular a sonda <ol><li> A sonda estimulante é feito de uma pipeta de vidro (14 cm de comprimento) equipado com um par de eletrodos de fio fino. Dicas de eletrodos são expostos (0,2 mm) para produzir um sinal eletrônico quando o animal é tocado pela sonda. Esta permite medir o tempo exato de estimulação. </li><li> Saídas de sonda estimulantes são amplificados (1000x) por um amplificador extracelular (AM Sistemas; Modelo 1700). O sinal é filtrado usando uma combinação de baixa freqüência (&lt;100 Hz) e alta freqüência de corte (&gt; 5 kHz). O sinal é então ligado a uma caixa de comutação e uma placa de aquisição de dados (National Instruments). Dados digitalizados é gravado, armazenados e analisados ​​utilizando dados de aquisição de software (Ferramentas Photron Motion). </li></ol> Parte 5: Gravações de vídeo <ol><li> Uma câmera de vídeo de alta velocidade (FASTCAM-X 1280 PCI, Photron) é posicionado perpendicular à câmara de gravação para fornecer uma visão lateral. Nível de luminosidade no interior da câmara de gravação deve ser ajustado para fornecer os melhores resultados, por exemplo, utilizando um iluminador pescoço de ganso ou de outras fontes de luz focusable. </li><li> Videografia de alta velocidade é combinada e sincronizada com gravações eletrônicas utilizando uma caixa de breakout e placa de aquisição de dados (National Instruments). Sinal amplificado dos eletrodos de banho está ligado à caixa de breakout e placa de aquisição de dados usando cabos BNC. Um gatilho mão-switch externo inicia a aquisição sincronizada de vídeo e dados. </li></ol> Parte 6: Procedimento Experimental <ol><li> Um único animal é introduzido na câmara e permissão para se aclimatar por 5 minutos. Escapar tail-flips são eliciadas por torneiras único de intensidade diferente na cabeça ou no abdômen, respectivamente. A intensidade das torneiras é controlado pelo experimentador. Cada flip-cauda escapar é gravado com vídeo de alta velocidade a uma taxa de quadros de 1000 pontos f / s, e os dados de potenciais de campo eletrônicos são registrados em 25 kHz. Início do banho e gravação de vídeo é iniciada por interruptor manual em uma caixa de gatilho. Tempo de gravação é determinado pela taxa de quadros escolhido (por exemplo, 1000 m / s = 4 seg tempo de gravação total). Post-e horários pré-acionar a gravação pode ser selecionada. </li><li> Nãoe: gravações eletrodo Bath deve ser verificado uma vez para cada espécie testada através da combinação de gravações eletrodo banho com outros métodos disponíveis gravações. Em lagostas, um par de eletrodos de prata pode ser implantado cirurgicamente ao redor do cordão nervoso ventral. Estímulos provocando tail-flips de escape pode ser aplicada e registada traços eletrônicos de eletrodos implantados e banho podem ser comparados. </li><li> Escapar-flip tail comportamento e atividade neural correspondente pode ser gravado em uma variedade de contextos diferentes, por exemplo, em resposta a ameaças visual, durante os ataques de predadores, ou durante os encontros agonísticos de duas lagostas. Tamanho da câmara, modo de gravação, etc tem que ser ajustada em conformidade (ver Discussão). </li></ol> Parte 7: A análise dos dados <ol><li> Frames de vídeo simples são analisados ​​usando o software de movimento da ferramenta (Photron). Traços eletrônicos são usados ​​para identificar o tipo de circuito neural que foi ativado por cada estímulo. Dados de vídeo é comparado com gravações sincronizadas fisiológicos para determinar o movimento do animal e do circuito neural ativado. Cada circuito ativado produz uma assinatura característica electrónica (ver resultados Representante). </li><li> Latência entre a sonda de contato e de resposta neural / muscular são calculados para cada experimento, medindo a demora entre o início do sinal de sonda eo início do sinal gravado com os eletrodos de banho. </li></ol> Parte 8: Resultados Representante A única série de frames de vídeo de alta velocidade e correspondentes gravações de campo elétrico para fugir da cauda flip-em resposta a um estímulo tátil entregue à cabeça ou a cauda de uma lagosta juvenil (Fig. 2). Fig. 2A: estímulo tátil forte na cabeça evocado uma cauda flip-controlados pelo circuito medial gigante. O aumento registrado do neurônio gigante (asteriscos) ea deflexão grandes fásica que se segue permite a não-ambígua de identificação da cauda-flip como mediada pela atividade de neurônios gigantes. O movimento para trás mostra os traços de vídeo determina a identidade do circuito neural ativado (MG). Fig. 2B: Rabo-flip mediada pelo circuito gigante laterais depois de um forte estímulo tátil foi aplicado à cauda. Movimento para cima e para frente visto no vídeo traços juntamente com o rastreamento eletrônico sincronizado exibindo o pico gigantes e os grandes, deflexão fásica inicial determina a identidade do circuito neural ativado (LG). Fig. 2C: Rabo-flip controlado por não-gigante de circuitos. Um estímulo mais gradual tátil foi entregue ao tórax do animal. Enquanto o movimento capturado em vídeo não permite a identificação inequívoca do circuito ativado, a gravação eletrônica não possui um pico gigante e consiste em identificar desvios muito menores do circuito ativado (Non-G). Fig. 3: medições de latência para os três tipos de fuga tail-flips. Tempo entre o contato da sonda e resposta fisiológica foi medido por sete animais. Gigante mediada tail-flips são eliciadas significativamente mais rápido do que os não-gigantes tail-flips. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> Figura 1: Um exemplo de uma câmara de gravação utilizado em nossos experimentos para animais de 2,5-3,5 cm de comprimento total. Os eletrodos de banho são colados em lados opostos da câmara, enquanto o fio terra está ligado ao lado mais longo da câmara e perpendicular aos eletrodos banho. Figura 2: quadros de vídeo é gravada em 1000 gravações m / seg e correspondentes eletrônicos para três diferentes tipos de estimulação. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A) Um forte estímulo tátil foi entregue para a cabeça do animal e provocou um gigante medial (MG) ​​mediada tail-flip. Seis vídeo-frames são exibidos à esquerda. Trace gravação da sonda utilizada para tocar o animal é mostrado em cinza, o ponto de contato é indicado pela seta preta. Trace gravação obtida com os eletrodos de banho é mostrado em azul. A inserção mostra o pico axônio pequeno gigante que precede a grandes deflexões fásica. Barras cinza correspondem aos quadros de vídeo, que figura na esquerda. O primeiro movimento notável da cauda do crustáceo, ocorreu no quadro n º 3, sete milésimos de segundo após o contato com a sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B) Um forte estímulo tátil foi entregue para a cauda do animal e provocou um gigante lateral (LG) mediada tail-flip. Seis vídeo-frames são exibidos à esquerda. Trace gravação da sonda utilizada para tocar o animal é mostrado em cinza, o ponto de contato é indicado pela seta preta. Trace gravação obtida com aeletrodos banho é mostrado em vermelho. A inserção mostra o pico axônio pequeno gigante que precede a grandes deflexões fásica. Barras cinza correspondem aos quadros de vídeo, que figura na esquerda. O primeiro movimento notável da cauda do crustáceo, ocorreu no quadro n º 3, oito milésimos de segundo após o contato com a sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) Um estímulo fraco e gradual tátil foi entregue para a cabeça do animal e provocou um não-gigante (Non-G) mediada tail flip-. Oito vídeo-frames são exibidos à esquerda. Trace gravação da sonda utilizada para tocar o animal é mostrado em cinza, o ponto de contato é indicado pela seta preta. Trace gravação obtida com os eletrodos de banho é mostrado em preto. O traço não tem o potencial de pico gigante, as deflexões inicial grande e consiste em potenciais de amplitude muito menor. Luz barras cinzentas correspondem aos quadros de vídeo, que figura na esquerda. O primeiro movimento notável da cauda do crustáceo, ocorreu no quadro n º 6, 115 milésimos de segundo após o primeiro contacto com a sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> Figura 3: Medidas de resposta de latência de sete animais diferentes de ambos os sexos e tamanhos semelhantes (média ± comprimentos STDV: 3.2 cm ± 0,2 cm, medido a partir rostro até telson). MG (barra azul) e LG (vermelho bar) tail-flips têm latências de resposta significativamente mais curto do que rabo-flips mediada por Non-G circuito (barra preta). Médias e desvios-padrão são mostrados. Barras com a mesma letra não diferiram significativamente entre si (teste de Wilcoxon Signed Posição para comparação de pares, p &lt;0,05).

<ol>
	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Não-invasivo gravações de atividade único neurônio ou ativação de circuitos neurais são difíceis de obter em animais desenfreada. O método descrito aqui fornece um meio para identificar padrões de ativação neurais subjacentes que ocorrem naturalmente comportamento. No passado, nós utilizado com sucesso esta técnica para medir os padrões de atividade neural nos circuitos de escapar de lagostas juvenis durante a formação de hierarquias de dominação social 1, dura...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

A relação entre padrões de atividade neural e expressão comportamental correspondente é difícil estabelecer em animais desenfreada. Tradicionais métodos não-invasivos requerem sujeitos de pesquisa, pelo menos parcialmente contido, e eles só permitem a identificação de um grande número de neurônios ativados simultaneamente. Por outro lado, pequenos conjuntos de neurônios ou neurônios individuais só podem ser medidos usando uma única célula gravações obtidas a partir de preparações em grande parte reduzida. Uma vez que a expressão do comportamento natural é limitada em animais contido e dissecados, os mecanismos neurais subjacentes que controlam esse tipo de comportamento são difíceis de identificar. Aqui, eu apresento uma técnica não-invasiva fisiológico que permite a medição de ativação de circuitos neurais em animais se comportando livremente. Usando um par de eletrodos de arame dentro de uma câmara cheia de água, os eletrodos banho de captação de potenciais de campo neural e muscular gerado por lagostas juvenis durante as respostas de fuga natural ou experimentalmente evocado. As respostas de fuga primária de lagostas são mediadas por três diferentes tipos de rabo-flips que se movem os animais longe do ponto de estimulação. Cada tipo de rabo-flip é controlado pelo seu próprio circuito neural; as duas respostas de fuga mais rápido e potente requer ativação de diferentes conjuntos de neurônios de comando de grandes dimensões. Em combinação com as observações comportamentais, as gravações eletrodo banho de permitir a identificação inequívoca destes neurônios e os circuitos associados neural. Assim, a atividade dos circuitos neurais subjacentes ao comportamento natural pode ser medida em animais e irrestrita em diferentes contextos comportamentais.

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Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Medidas não invasivas de padrões de atividade neural em animais livremente comportando são obtidos através da combinação de gravações neurofisiológicos com videografia de alta velocidade.

Gravações da ativação do circuito neural no Livremente Behaving Animais

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.5K visualizações.  University of Maryland. Medidas não invasivas de padrões de atividade neural em animais livremente comportando são obtidos através da combinação de gravações neurofisiológicos com videografia de alta velocidade.

Vídeo: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Biologia

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Medidas de freqüência cardíaca e ventilatória em se movimentar livremente Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC Assay Activation GTPase

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Modelagem de Membranas Biológicas, com placas de circuito e medição de sinais elétricos em Axônios: Exercícios Laboratório Student

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Realizando lavado vaginal, Crystal coloração violeta, e avaliação citológica vaginal para Rato Identificação ciclo estral Staging

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...