Name: isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

1. cânula e Preparação Câmara <ol><li> Inserir capilares de vidro de borosilicato limpo (diâmetro externo: 1,2 milímetros; diâmetro interno: 0,69 mm, 10 mm de comprimento) nas ranhuras de um puxador de pipeta com um filamento de platina (diâmetro: 100 mm). </li><li> Usando as configurações apropriadas, puxar o tubo capilar para gerar uma cânula com uma longa e fina ponta (Figura 2), utilizando um puxador de micropipeta. As definições utilizadas são: Heat - 700, Pull - 100, velocidade - 50, Time - 10. </li><li> Inserir uma cânula para o titular da câmara de myograph pressão. Alinhe as cânulas de forma adequada. </li><li> Cuidadosamente quebrar as pontas das cânulas, utilizando um fórceps sob o microscópio de dissecação para o diâmetro desejado. Aqui demonstramos uma cânula com uma ponta de 10 uM (Figura 2). </li><li> Encha ambas as cânulas com fluido cerebrospinal artificial (aCSF) contendo Ca 2+ 1,8 mM; encher a câmara com Ca 2 + livre aCSF suplementado com soro de bovino a 1%albumina (BSA) + Diltiazem 10 uM (todas as soluções devem ser preparadas antes do início da experiência). Dependendo do tamanho da câmara, variar o volume de aCSF entre 5 a 20 ml. Armazenar a câmara a 4 ᵒ C até que esteja pronto para começar a canulação. NOTA: O diltiazem é um fechado inibidor reversível de cálcio tipo-L de tensão que irá causar a dilatação de arteríolas, que facilita a canulação </li></ol> 2. Isolamento de parenquimatosa Arteríolas <ol><li> Eutanásia do animal imediatamente antes da dissecção utilizando protocolos padrão no laboratório que são aprovados pelo comitê de cuidados com os animais da instituição. A utilização de barbitúricos ou o dióxido de carbono é preferido, como outros anestésicos comumente utilizados podem ter efeitos vasodilatadores na circulação cerebral 15. Todos os procedimentos com animais mostrados aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade de Nevada School of Medicine, e estão em agreement com os Institutos Nacionais de Saúde &quot;Princípios Orientadores do Cuidado e Uso de Animais&quot;. </li><li> Eutanásia do animal utilizando dióxido de carbono. Antes de decapitação, garantir que o animal parou de respirar e não responde quando beliscar suas patas. </li><li> Decapitar o animal usando uma tesoura afiada (mouse) ou guilhotina (rato). Retire a pele da cabeça do animal e corte ao longo da linha média suturas cranianas usando uma tesoura de ponta fina. Usando uma pinça sem corte (ratinho) ou um alicate óssea remova cuidadosamente os ossos cranianos e expor o cérebro. Remover o cérebro devagar e com cuidado para não danificar artérias pial superfície. Coloque o cérebro em um recipiente cheio com 20 ml de Ca 2 + livre aCSF suplementado com BSA a 1% em gelo. </li><li> Encher um prato de dissecação contendo um bloco com gelada isenta de Ca2 + aCSF suplementado com 1% de BSA e transferir o cérebro, com a superfície ventral para cima para este prato (Figura 2A). Coloque o prato sob a dissecçãoTing microscópio (Figura 3A). Pin o cérebro para a almofada com agulhas de calibre 27. Tenha cuidado para evitar a colocação de pinos perto da artéria cerebral média (MCA). </li><li> Localizar o Círculo de Willis eo MCA ramificação dela. Usando Vannas mola tesoura afiada e alinhada, cortar um pequeno retângulo ao redor do MCA. Certifique-se de que rectângulo é cerca de 5 mm de espessura ao longo de todo o comprimento da MCA. A parte superior do retângulo deve ser passado o ponto de ramificação do Círculo de Willis (proximal ao Círculo de Willis, Figura 2B, seta). </li><li> Usando as tesouras mola Vannas, executar um corte inferior para a profundidade do tecido durante aproximadamente 2-3 mm. NOTA: Esta parte é fundamental para um bom isolamento das arteríolas do parênquima, e isso pode levar algumas tentativas para obtê-lo direito. Se o corte é a nota feita a uma profundidade suficiente, as arteríolas parênquima isoladas será curta; se o corte é muito profundo, as arteríolas vai quebrar em seu ponto de ramificação quando a dissecadostecido é removido. </li><li> Fixar para baixo o final mais distal da fatia do cérebro para o prato de dissecação com o MCA virada para cima (distal do Círculo de Willis), utilizando os pinos de insetos. Faça uma incisão pouco profunda para cortar a pia perto do pino, tomando cuidado para não cortar demasiado profundamente no córtex cerebral subjacente (caso contrário, os pinos não vai segurar). </li><li> Cuidadosamente pegar cada lado da pia com pequenas pinças e começar a descascar a pia do córtex. Se necessário, segurar o MCA, garantindo que a membrana pial circundante não está danificado. </li><li> Manter a casca até Pia contendo a MCA é livre a partir do córtex. Note-se que a resistência contra descamação vai aumentar perto do Círculo da Willis. Tenha cuidado extra neste ponto, porque as arteríolas parênquima mais longos será nesta região. </li><li> Uma vez que a pia é livre, coloque-o cuidadosamente em cima da almofada no prato de dissecação com a superfície oposta à do parênquima arteríolas virados para baixo (Figura 2B). </li> &lt;li&gt; Usando Vannas mola tesoura, cortar as arteríolas dissecados livres do MCA, certificando-se as extremidades do navio são cortadas sem rodeios. </li><li> arteríolas recolhidos podem ser utilizados para Miografia pressão, a análise molecular, ou o isolamento de músculo liso nativa ou células endoteliais. </li></ol> Miografia 3. Pressão <ol><li> Prepare a sutura antes do tempo. Cortar o fio de nylon verde escuro em pedaços de 5 mm e coloque no lado pegajoso de uma fita dupla face em uma placa de Petri. Sob o microscópio de dissecação, separar cada parte nos seus filamentos utilizando uma pinça fina e frouxamente preparar um nó meia-engate simples fazendo passar uma extremidade do filamento para o outro. </li><li> Utilizando uma pinça, pegar um nó fora da fita dupla face, tomando cuidado para não agarrá-lo com muita pressão. Puxar o fio de sutura na solução do banho, nó deslizante na cânula e apertá-lo a uma distância a partir da ponta da cânula. Repita esse processo para ter 2 suturas em cada cânula. </li><li> Brasão um copomicropipeta com uma solução de BSA a 10% e em seguida enxaguar o excesso de Ca2 + aCSF -livre suplementado com 1% de BSA. </li><li> Retire 50 ml de solução para a micropipeta de vidro, puxe uma arteríola do parênquima e transferir para a câmara Miografia pressão. Empurrar o êmbolo com um movimento de fluido para dispensar a arteríola do parênquima para dentro da câmara para evitar que se colem à câmara interna da micropipeta de vidro. </li><li> Utilizando duas pinças super fino, abra o lúmen do PA, sendo o cuidado de só tocar o final do navio. </li><li> Usando as pinças para prender os bordos da arteríola parenquimatosa, puxar cuidadosamente o navio para a cânula. Puxar o suficiente sobre a cânula de modo a que o recipiente não é no final muito afunilada da cânula (Figura 3A). </li><li> Soltar os 2 suturas na cânula e apertá-los a bordo do navio (Figura 3B). Espaço das suturas de distância um pouco sobre o vaso, e puxe para o operador enquanto tighdez lo. Certifique-se de que quaisquer ramos são amarrado antes de fechar a extremidade oposta da arteríola do parênquima. </li><li> Ligue câmara em torno e fechar a extremidade oposta da arteríola parenquimatosa como um saco-cego. Para conseguir isso, abra os laços sobre a cânula oposto e passá-lo para o arteriole. Lentamente fechar o nó de tal maneira que a arteríola parenquimatosa vai ser ligada ao lado da cânula. Evite estiramento longitudinal da arteríola. (Figura 3C). NOTA: Se o objectivo do estudo é para perfundir as drogas através do lúmen, canular a extremidade oposta, em vez de amarrar da arteríola do parênquima para o lado da cânula. Certifique-se as cânulas não tem nenhum cristais de sal ou acúmulos de internos que bloqueiam o fluxo intraluminal. Regular a taxa de fluxo de forma adequada, a fim de manter a tensão de corte dentro dos níveis fisiológicos. Um estudo realizado por Shih et al. Mostra as taxas de fluxo dentro penetrando arteríolas em ratos 8, e pode servir como um guia inicial para piestudos muito. </li><li> Transferir cuidadosamente a câmara para a fase do microscópio para ser utilizado para gravar o diâmetro dos vasos. Fixe a câmara para o palco microscópio, ligando sonda de temperatura e entrada e saídas para perfusão aos tubos corretos. Pressurizar a arteríola para 40 mmHg de pressão intraluminal para arteríolas parenquimatosas do rato ou 50 mmHg para arteríolas de rato, usando um sistema de pressão disponíveis no laboratório (coluna de água, a bomba peristáltica acoplada a um transdutor de pressão, etc.). A Figura 4D mostra um exemplo de um bomba peristáltica acoplada a um transdutor de pressão para pressurizar o arteríola canulada. </li><li> Ligue o sistema usado para detectar alterações no diâmetro (Figura 3E). Ajustar as definições sobre o microscópio, tais como iluminação e contraste, a fim de obter a melhor detecção possível. Idealmente as paredes da arteríola deve ser escuro e translúcido lúmen. Uma vez que a detecção é apropriado, iniciar a gravação de tele experimentar. </li><li> Inicie o sistema de superfusão. Lava-se a cânula, pressurizado arteríola parenquimatosa com aCSF quente (37 ᵒ C) contendo Ca 2+ 1,8 mM durante 15 a 20 min a uma taxa de fluxo entre 3-5 ml / min. Este aCSF não deve conter Diltiazem ou BSA. </li><li> Substitua o aCSF regular com 60 mM KCl aCSF para avaliar a viabilidade da preparação. Neste ponto deve PAs exibem 10-20% constrição ao KCl 60 mM. Se o arteriole não contraem nessa medida, remover e canular outra arteriole. </li><li> Lavar a KCl 60 mM com aCSF regular. Espere até que geração de tom miogênica espontânea, o que poderia levar até uma hora. Se arteriole não tem tom miogênica até então, substituí-la por outra arteriole. NOTA: Miogênica tom é observada como um processo gradual, e por vezes mais lentas, a redução do diâmetro do lúmen do vaso, sem estimulação por agonistas contrácteis ou solução de alta KCl. tom miogênica é calculada pela seguinte formula: (1 - (diâmetro do lúmen ativo / diâmetro luminal passiva)) x 100 5 Uma quantidade apropriada de tom miogênica pode variar de acordo com os tratamentos, distensões, espécie, transgênicos, etc.. Em geral, o tom miogénica fisiológica varia de 15 - 30% 5. </li></ol> 4. Exemplo Experimentos Miografia Pressão: induzida por agonista constrição e Miogênica reatividade <ol><li> Prepara-se uma série de diluições de um agonista de escolha em aCSF usando concentrações apropriadas. Para o exemplo de corrente foi utilizado o tromboxano A2 agonista do receptor de U46619. Uma solução de estoque de 1 ml de U46619 a uma concentração de 1 mM foi preparada. Transferir 100 ul da solução de 1 mM para um novo tubo contendo 900 jil de aCSF para obter uma diluição de 10 vezes do fármaco, resultando em uma solução contendo 100 uM U46619. Repetir este processo por 6 diluições, que varia de 1 mM a 100 nM para preparar uma curva de concentração-resposta do constrictor. </li><li> Adicione otodo o volume da solução que contém o agonista (1 ml para a primeira dose, seguida por 900 ul de todas as doses subsequentes) para 100 ml de superfusing aCSF. Isto irá levar a uma diluição extra de 100 vezes o número de agonista. Assim, as concentrações finais do agonista na gama de banho de 10 pM a 10 uM. Permitir que as arteríolas se a incubar durante ~ 10 minutos em cada concentração, até que atinge um diâmetro luminal de estado estacionário. </li><li> Lavar o agonista por superfusing PAs com aCSF sem drogas até que o diâmetro PA está de volta ao valor original. Incubar a arteríola do parênquima em Ca 2 + livre aCSF (sem BSA) suplementado com 10 mM Diltiazem + 2 EGTA mM para induzir a dilatação máxima e gravar diâmetro passiva da arteríola. </li><li> Remova o arteriole parênquima da cânula, puxando-o com cuidado para fora, mantendo na extremidade dos laços. Lava-se a câmara de recipiente com água desionizada duas vezes para remover os detritos e excesso de agonista. Encha a câmara com Ca2+ aCSF -livre + BSA e canular outra arteriole. Não é recomendado para executar mais de uma experiência por arteríolas. </li><li> Para realizar uma experiência reactividade miogénico, permitir a arteríola parenquimatosa a equilibrar a 40 mmHg de pressão intraluminal até miogénica tom espontâneo é gerado (descrito acima). Reduzir a pressão intraluminal de 5 mmHg e PA permitir a equilibrar durante ~ 5 - 10 min, até diâmetro luminal atinge o estado estacionário. Aumentar a pressão intraluminal por passos usando o intervalo de escolha (por exemplo, de 5 a 140 mmHg, em incrementos de 20 mmHg). </li><li> Não exponha o arteriole à pressão intraluminal inferior a 5 mmHg, como que poderia causar o colapso e danificar o endotélio, alterando assim os resultados do experimento. </li><li> No final da curva de pressão, superfuse arteríola parenquimatosa com Ca 2 + livre aCSF (sem BSA), suplementado com 10 uM de diltiazem + EGTA 2 mM e repetir as etapas de pressão, a partir da Lowesa pressão t. NOTA: Isto vai dar os diâmetros passivos do PA, que são necessários para calcular% tom miogênica, definidos pela fórmula:% de tom = (1 - (diâmetro ativa diâmetro / passivo)) x 100. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

arteríolas parênquima cerebral são arteríolas de alta resistência com poucas anastomoses e ramos que perfundem populações neuronais distintas. Estes vasos sanguíneos especializados são jogadores centrais na auto-regulação cerebrovascular e acoplamento neurovascular através de vasodilatação mediada por astrócitos 1. A importância destes vasos sanguíneos especializados na doença vascular cerebral é conhecida há aproximadamente 50 anos, quando o trabalho pioneiro do Dr. Miller Fisher descreve...

A circulação cerebral é organizado exclusivamente para suportar as demandas metabólicas dos neurônios centrais, células que têm limitado as reservas de energia e, consequentemente, eram altamente sensíveis a mudanças na pressão de oxigênio e fornecimento de nutrientes necessários. Como particulares subpopulações neuronais torna ativo quando tarefas específicas são realizadas, a vasculatura promove um aumento altamente localizada na perfusão para evitar hipóxia local e esgotamento de nutrientes 1. Esta é uma forma de hiperemia funcional conhecida como acoplamento neurovascular, e depende do funcionamento adequado da unidade neurovascular, composto de neurónios, astrócitos, activas e artérias cerebrais 2. Arteríolas parênquima intracerebrais, um grupo de vasos sanguíneos que abrangem parênquima, penetrantes e arteríolas pré-capilares, são centralmente importante para esta resposta e é então crítica para estudá-los individualmente a fim de investigar o acoplamento neurovascular 3. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; arteríolas parenquimatosas são pequenas (20-70 mm de diâmetro interno) vasos sanguíneos de alta resistência que perfundem populações neuronais distintas dentro do cérebro. Ramificação para fora a partir de artérias piais na superfície, arteríolas parenquimatosas penetrar no parênquima cerebral em um ângulo de cerca de 90 ᵒ para alimentar a microcirculação subsuperfície (Figura 1). Estes arteríolas desempenhar um papel crítico na manutenção da pressão de perfusão adequada, tal como eles são os vasos contendo musculares lisas mais distais que protegem os capilares. Em contraste com a circulação pial superfície, arteríolas parenquimatosas falta ramos colaterais e anastomose, e, consequentemente, são &quot;estrangulamento&quot; da circulação cerebral 4. Como resultado, a disfunção das arteríolas parenquimatosas contribui para o desenvolvimento de doenças cerebrovasculares, tais como comprometimento cognitivo vascular e pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos (também conhecido como acidentes vasculares cerebrais silenciosas ou lacunares). estudos indicade que a disfunção do parênquima arteríolas pode ser induzida por hipertensão essencial 5, stress crónico 6, e é um evento precoce em doença dos pequenos vasos modelo de ratinho genética 7. Oclusão Além disso, induzida experimentalmente das arteríolas penetrantes única em ratos é suficiente para causar pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos, que são de forma cilíndrica, semelhante aos observados em humanos mais velhos 8. Além dessas distinções anatômicas, mecanismos que regulam a função contrátil diferem entre artérias e arteríolas pial do parênquima. Vasoconstrição Miogênica é maior nas arteríolas parenquimatosas 9, possivelmente devido à falta de inervação extrínseca 10, modos distintos de mecanotransdução 11, e diferenças no Ca2 + intracelular de sinalização 12,13 nas células musculares lisas vasculares. A evidência sugere que os mecanismos vasodilatadores dependentes do endotélio também diferem entre estes vascusegmentos Lar, com artérias do parênquima que exibem uma maior confiança nos mecanismos que envolvem Ca 2+ -activated canais de K + e comunicação eletrotônicos dentro da parede vascular em comparação com fatores difusï¿½eis tais como óxido nítrico e prostaciclinas 14. Portanto, os dados reunidos em experimentos usando artérias pial pode não se aplicam necessariamente a do parênquima arteríolas, deixando uma lacuna no nosso conhecimento sobre o controle local da perfusão cerebral. Apesar da sua importância, arteríolas do parênquima são vastamente sub-estudado, principalmente devido aos desafios técnicos com isolamento e de montagem para o estudo ex vivo. Neste artigo é descrita uma metodologia para isolar e canular arteríolas do parênquima cerebral, o que pode ser utilizado para Miografia pressão, ou para isolar o tecido por imunomarcação, electrofisiologia, biologia molecular, bioquímica e análise.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Artificial Cerebrospinal Fluid&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Isolation/Cannulation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &amp;mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles

arteríolas parênquima intracerebrais (PAs), que incluem arteríolas parênquima, arteríolas penetrantes e arteríolas pré-capilares, são os vasos sanguíneos de alta resistência que ramificam para fora das artérias e arteríolas pial e mergulhar no parênquima cerebral. PA indivíduo perfundir um território cilíndrica discreta do parênquima e os neurônios contidos. Essas arteríolas é um jogador central na regulação do fluxo sanguíneo cerebral, tanto globalmente (autorregulação vascular cerebral) e localmente (hiperemia funcional). PAs são parte da unidade neurovascular, uma estrutura que corresponde ao fluxo sanguíneo regional de actividade metabólica no interior do cérebro e também inclui neurónios, astrócitos e interneurónios,. Perfusão através PAs está diretamente ligado à atividade de neurônios em que determinado território e aumentos de chumbo metabolismo neuronal a um aumento na perfusão local causado pela dilatação do feed PA. Regulamento das AP é diferente do melhor caracterizadaartérias pial. vasoconstrição induzida pela pressão é maior nos PAs e mecanismos vasodilatadores variar. Além disso, PAs não recebem a inervação extrínseca dos nervos perivasculares - inervação é intrínseca e indireta na natureza através do contato com endfeet astrocitário. Assim, os dados relativos a regulação contrátil acumuladas pelos estudos utilizando artérias pial não se traduz diretamente para a compreensão da função PA. Além disso, permanece indeterminada como os estados patológicos, tais como hipertensão e diabetes, afetar a estrutura PA e reactividade. Essa lacuna de conhecimento é, em parte, uma consequência das dificuldades técnicas relativas ao isolamento PA e canulação. Neste artigo apresentamos um protocolo para o isolamento e canulação de PAs de roedores. Além disso, mostramos exemplos de experiências que podem ser realizadas com estas arteríolas, incluindo constrição induzida por agonista e reactividade miogénica. Embora o foco deste artigo é sobre PA canulação e Miografia pressão, isolado PAs também pode ser utilizado para estudos bioquímicos, biofísicos, moleculares, e de imagem.

A Figura 5A mostra uma constrição representante das AP de ratinho a 60 mM de KCl aCSF para avaliar a integridade da preparação. AP deve constrição entre 15 - 30% na presença de KCI 60 mM. Se a constrição é inferior a 15%, o PA e descartar canular uma outra, uma vez que sugere que a arteríola foi danificado durante o processo de isolamento e a canulação. A Figura 5B ilustra PA cons...

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Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K visualizações.  University of Nevada School of Medicine. This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

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Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Permanente oclusão vascular cerebral<em&gt; Via</em&gt; Dupla ligadura e transecção

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Medicina

Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs must be tailored specifically to the lesion, with surgical resection being the gold standard for small, accessible lesions. Pre-operative embolization of AVMs can reduce nidal blood flow and remove high-risk AVM features such as intranidal or venous aneurysms, thereby simplifying a challenging neurosurgical procedure. Herein, we describe our approach for the staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and highlight the advantages of having a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team. This includes planning the craniotomy and resection to immediately follow the final embolization stage, thereby using a single session of anesthesia for aggressive embolization, and rapid resection. Finally, we provide a representative case of a 22-year-old female with an unruptured right frontal AVM diagnosed during a seizure workup, who was successfully treated via staged embolizations followed by open surgical resection.

Surgery is the gold standard for accessible arteriovenious malformations (AVMs), and pre-operative embolization can simplify this procedure. We describe our approach for staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and provide a representative clinical example highlighting the advantages of a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team.

Tratamento cirúrgico aberto de malformações arteriovenosas cerebrais e abrangente Endovascular

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs ...

Neurociência

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biologia

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three decades, its standardization remains inadequate. Predominantly conducted on rats and mice, the procedure poses challenges due to mice's smaller and more fragile nature. Unlike the Koizumi common carotid artery method, the Longa external carotid artery is the sole intraluminal filament stroke model ensuring complete reperfusion post-ischemia. This aspect holds critical significance for studies investigating reperfusion phenomena. The surgical modifications demonstrated in this article ensure continuous blood flow from the common carotid artery throughout the ischemic phase and after the reperfusion onset. The goal of these modifications is to selectively occlude the middle cerebral artery by keeping the perfusion uninterrupted in branches proximal to the middle cerebral artery during the ischemia period. Furthermore, the onset of reperfusion is sudden and can be precisely controlled, thereby modeling endovascular thrombectomy in human medicine more accurately. Our aim in presenting this comprehensive video article is to ease the training of new surgeons and promote the standardization of surgical procedures within the scientific community.

This protocol presents a step-by-step guide for researchers to perform the middle cerebral artery occlusion procedure on mice using the modified Longa external carotid artery method. Modifications presented in this article aim to increase the accuracy of middle cerebral artery occlusion and ensure complete reperfusion.

Otimização do Método de Oclusão da Artéria Cerebral Média Longa para Reperfusão Completa

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Hakim, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63463">Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparando tubos endoteliais cerebrais a partir de arteríolas parenquimatosas de camundongos

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1.&#160;Solutions and drugs

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