Nosso protocolo supera a janela limitada de imagem de bioluminescência, incluindo uma tag GFP que também facilita a detecção e quantificação da micrometastase pela análise de PCR. Como a tag GFP contorna a janela limitada de aquisição de bioluminescência, mais sujeitos podem ser imagens sem a perda de sinal e o potencial para resultados falsos negativos é limitado. Este estudo será útil aos pesquisadores para a avaliação da eficácia terapêutica dos agentes anticâncológicos.
Essa metodologia fornece um modelo útil para pesquisadores interessados em EMT, resistência a medicamentos e mecanismos de células-tronco cancerosas relacionados ao processo metastático, bem como para o desenvolvimento de medicamentos anticâncicos. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, cochila a quarta glândula mamária esquerda com álcool e use fórceps finos de dentes de rato para levantar ligeiramente a quarta glândula mamária. Certificando-se de que a ponta é chanfrada para cima, insira uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de um mililitro contendo 100 microliters de mistura de matriz de membrana de porão celular e retraia levemente o êmbolo para garantir que a agulha não entre em contato com nenhum vaso sanguíneo.
Para resultados comparativos, o local de injeção de células tumorais deve ser consistente entre todos os animais receptores. Se nenhum sangue entrar na seringa, injete lentamente todo o volume da solução na almofada de gordura mamária. Uma massa redonda levantada aparecerá sob a pele.
Aguarde de 10 a 15 segundos para que a matriz de membrana do porão endureça antes de remover a agulha e permita que o xenoenxerto cresça livremente sem interrupção por sete a dez dias antes de realizar uma medição do tamanho do tumor. Em seguida, use pinças para medir o tamanho do xenoenxerto em todos os camundongos e determinar o volume do tumor usando a equação como indicado. Antes de imaginar os animais do estudo, imagem três tumores adicionais com camundongos por 40 minutos em intervalos de dois minutos usando os parâmetros indicados para obter a cinética de luciferina para o estudo.
Use o sinal de bioluminescência medido de pico para definir a janela de tempo ideal de aquisição de imagem para todos os pontos de tempo subsequentes. Para realizar a imagem de metástase, cubra o tumor primário com uma manga cortada de uma luva preta e coloque um rato anestesiado no scanner e, em seguida, imagine o sinal de luciferina usando os mesmos parâmetros que apenas demonstrado com o lado ventral do mouse voltado para a câmera para a imagem de metástase pulmonar e o lado dorsal do mouse voltado para a câmera para a imagem de metástase cerebral. Usando um software de análise de scanner e dados, desenhe uma região de interesse sobre a área de imagem para garantir que todo o órgão de interesse seja coberto para permitir a avaliação da carga metastática e quantificar a saída de bioluminescência como o fluxo total e fótons por segundo.
Imediatamente após a quantificação do sinal de bioluminescência, colhia o cérebro e o tecido pulmonar e enxágue rapidamente os órgãos em PBS para remover quaisquer manchas de sangue superficiais. Coloque os órgãos em uma placa de plástico preta de baixa fluorescência automática e transporte as amostras para um scanner de fluorescência multiespectral equipado com capacidade de desenixamento espectral para detecção de GFP. Para adquirir imagens multiespectrais de GFP dos órgãos extraídos, escaneie os órgãos de 500 a 720 nanômetros com tamanho de passo de 10 nanômetros.
Para obter o perfil de fluorescência automática tecidual, escaneie órgãos excisados de camundongos de controle não injetados. Além disso, os tecidos positivos da imagem GFP, como o tumor primário, adquirem fluorescência automática, perfil de GFP misto. Processe esses espectros de acordo com o protocolo do fabricante para estabelecer uma biblioteca espectral com perfis de GFP e fluorescência automática puros.
Depois de confirmar a precisão da biblioteca espectral e separar o sinal GFP do fundo de fluorescência automática do tecido, utilize a mesma biblioteca para desmixar todas as imagens em estudo. Para extração de DNA após o congelamento do estalo, coloque todo o cérebro em um tubo homogeneizador de cinco mililitros contendo dois mililitros de tampão de dna e use um conjunto de homogeneizador para 50 para homogeneizar o tecido. Quando o tecido estiver totalmente homogeneizado, transfira um mililitro do lysate para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros e isole o DNA de acordo com o protocolo do fabricante.
Adicione 500 microliters de 100% etanol ao isolado e misture a amostra por inversão. Depois de três minutos em temperatura ambiente, use uma pipeta para transferir o DNA semelhante à lã precipitar para um novo tubo livre de dois mililitros DNAse e RNAse. Deixe a amostra secar por um minuto antes de adicionar um mililitro de 75% de etanol ao tubo e inverter o tubo três a seis vezes para lavar a amostra.
Descarte o etanol após a última inversão antes de lavar o DNA mais duas vezes com etanol fresco por lavagem como apenas demonstrado. Após a última lavagem, o ar seque a amostra por 10 segundos antes de dissolver o DNA em 52 microlitres de oito milimônios hidróxido de sódio. Transfira uma alíquota de dois microliter de DNA para um frasco espectrofotômetro e quantifique a concentração de DNA na amostra usando uma razão de absorvância entre A260 e 280 de acordo com a fórmula.
Ajuste a concentração de DNA da amostra para 50 nanogramas por microliter com hidróxido de sódio adicional de oito milimônios e projete o par de primer específico para a exógena sequência GFP verde internamente usando um portal web de design de primer de código aberto para a detecção pcr em tempo real da tag GFP e as células metastáticas que invadiram e colonizaram os locais distais do tumor. Em seguida, use um reagente PCR rápido em tempo real e uma máquina PCR em tempo real que suporta um protocolo PCR rápido em tempo real para análise quantitativa de PCR em tempo real da amostra. Para a detecção de células cancerígenas metastáticas de mama no pulmão, use uma tesoura dissecando para abrir a cavidade torácica e cortar o coração e o timo para expor a traqueia.
Insira uma agulha de calibre 22 presa a uma seringa de 10 mililitros contendo solução Bouin na traqueia e deprime o êmbolo até que os pulmões colapsados fiquem inchados com aproximadamente dois mililitros da solução. Remova a seringa e a agulha uma vez que os pulmões tenham sido inflados e transfira todo o pulmão para um tubo de 15 mililitros contendo solução bouin fresca. Inverta suavemente o tubo algumas vezes antes de deixar o tecido de molho por 24 horas em temperatura ambiente.
No dia seguinte, enxágue o pulmão com água e coloque a amostra em um tubo de 70% de etanol. Em seguida, use um microscópio dissecando para contar o número de manchas brancas metastáticas e nódulos nas superfícies dos pulmões. A medição do volume do tumor por pinça é um método bem estabelecido para avaliar a eficácia do tratamento.
Para obter sinais comparáveis entre os grupos de estudo, um estudo de cinética bli pré-imagem deve ser realizado para determinar o melhor prazo de imagem. Devido à relação sinal-fundo superior, todo o corpo in vivo BLI é bastante sensível na detecção de sinais de metástase de baixo nível em comparação com a abordagem GFP. No entanto, devido à natureza estável da molécula de GFP, os pesquisadores têm tempo suficiente para processar a carcaça antes de capturar os sinais de GFP de órgãos-alvo em estudos de dois repórteres.
Este exemplo da vida real demonstra como as medidas do tamanho do tumor de pinça podem distorcer a interpretação dos dados, pois este xenoenxerto perdeu a maior parte do conteúdo viável das células tumorais enquanto ainda mantinha sua grande massa e forma. A detecção molecular por PCR em tempo real também pode fornecer evidências convincentes de metástase cerebral no modelo ortotópico de câncer de mama usando sequenciamento de DNA GFP exógeno, pois a sequência de DNA GFP transfecida não existe naturalmente em humanos ou roedores. O local de implantação deve estar fisiologicamente e anatomicamente relacionado à malignidade do câncer.
Tanto o gene tumor e a expressão proteica podem ser avaliados em locais primários e distais e as células metastáticas podem ser isoladas para maior caracterização.
