당사의 프로토콜은 PCR 분석을 통해 미세메타증의 검출 및 정량화를 용이하게 하는 GFP 태그를 포함시킴으로써 제한된 생체 발광 이미징 창을 극복합니다. GFP 태그는 제한된 생체 발광 획득 창을 우회하기 때문에 신호 손실 없이 더 많은 피험자가 이미지화될 수 있으며 거짓 부정적인 결과에 대한 잠재력이 제한됩니다. 이 연구는 항암제의 치료 효능의 평가를 위해 연구원들에게 유용할 것이다.
이러한 방법론은 EMT, 약물 내성 및 항암 약물 개발에 대한 전이성 과정과 관련된 암 줄기 세포 메커니즘에 관심이 있는 연구자를 위한 유용한 모델을 제공한다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 알코올왼쪽 네 번째 유방 동맥을 면봉하고 약간 네 번째 유방 선을 들어 올려 미세 쥐 치아 집게를 사용합니다. 팁이 벨이 울리도록, 세포 지하 막 매트릭스 믹스의 100 마이크로 리터를 포함하는 1 밀리리터 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입하고 바늘이 혈관에 접촉하지 않도록 플런저를 약간 철회합니다.
비교 결과를 위해, 종양 세포 주입 사이트는 모든 수신자 동물 들 사이에서 일관되어야 합니다. 혈액이 주사기에 들어가지 않으면 용액의 전체 부피를 유방 지방 패드에 천천히 주입하십시오. 둥근 올려지는 질량이 피부 아래에 나타납니다.
바늘을 제거하기 전에 지하 막 매트릭스가 굳어지고 종양 크기 측정을 수행하기 전에 7 ~ 10 일 동안 중단없이 자유롭게 성장할 수 있도록 지하 막 매트릭스가 10 ~ 15 초 기다립니다. 그런 다음 캘리퍼를 사용하여 모든 마우스에서 이종이 이식의 크기를 측정하고 표시된 대로 방정식을 사용하여 종양 부피를 결정합니다. 연구 동물을 이미징하기 전에, 연구 결과를 위한 루시페린 운동학을 얻기 위하여 지시된 바와 같이 파라미터를 사용하여 2 분 간격으로 40 분 동안 3개의 추가 종양 베어링 마우스를 심상.
피크 측정 된 생체 발광 신호를 사용하여 후속 모든 시간 지점에 대한 최적의 이미지 수집 시간 창을 정의합니다. 전이 영상을 수행하기 위해, 검은 장갑에서 절단 슬리브와 기본 종양을 커버하고 스캐너에 마취 마우스를 배치 한 다음 폐 전이 영상과 뇌 대사를위한 카메라를 향한 마우스의 복부 측으로 입증 된 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 루시퍼린 신호를 이미지화. 스캐너 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여, 전이성 부담을 평가하고 초당 총 플럭스 및 광자로 생체 발광 출력을 정량화하기 위해 관심있는 전체 기관이 커버되도록 이미지 영역에 관심 영역을 그립니다.
생물 발광 신호 정량화 직후, 뇌와 폐 조직을 수확하고 신속하게 어떤 피상적 인 혈액 얼룩을 제거하기 위해 PBS에서 장기를 헹구. 낮은 자동 형광 블랙 플라스틱 플레이트에 장기를 놓고 GFP 검출을 위한 스펙트럼 미혼 기능이 장착된 다중 스펙트럼 형광 스캐너로 샘플을 운반합니다. 추출된 장기의 다중 스펙트럼 GFP 이미지를 획득하려면 10나노미터의 단계 크기로 500~720나노미터의 장기를 스캔합니다.
조직 자동 형광 프로파일을 얻으려면 주입되지 않은 제어 마우스의 절제 된 장기를 스캔하십시오. 또한, 상이미지 GFP 양성 조직은 자동 형광 혼합 GFP 프로파일을 획득하기 위해 1차 종양과 같은 양성 조직. 제조업체의 프로토콜에 따라 이러한 스펙트럼을 처리하여 순수 GFP 및 자동 형광 프로파일을 사용하여 스펙트럼 라이브러리를 설정합니다.
스펙트럼 라이브러리의 정확성을 확인하고 조직 자동 형광 배경에서 GFP 신호를 분리 한 후 동일한 라이브러리를 사용하여 연구에서 모든 이미지를 분리하십시오. 스냅 동결 후 DNA 추출의 경우, DNA 리시스 완충제의 2밀리리터를 포함하는 5밀리리터 균질화 튜브에 전체 뇌를 배치하고 조직을 균질화하기 위해 50으로 설정된 균질화를 사용합니다. 조직이 완전히 균질화되었을 때, Lysate의 1 밀리리터를 DNAse 및 RNAe무료 2 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮기고 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA를 분리합니다.
분리에 100% 에탄올의 500 마이크로리터를 추가하고 반전으로 샘플을 혼합합니다. 실온에서 3분 후, 파이펫을 사용하여 양모와 같은 DNA 침전을 새로운 2밀리리터 DNAse 및 RNAe 무료 튜브로 옮기십시오. 시료를 1분 동안 건조하게 한 후 튜브에 75%에탄올1밀리리터를 추가하고 튜브를 3~6회 반전하여 시료를 세척합니다.
마지막 반전 후 에탄올을 버리고 DNA를 세척당 신선한 에탄올로 두 번 더 세척합니다. 마지막 세척 후, 공기는 8 밀리머 나트륨 수산화의 52 마이크로 리터에서 DNA를 용해하기 전에 10 초 동안 샘플을 건조. DNA의 2개의 마이크로리터 알리쿼트를 분광광계 대용체로 옮기고 공식에 따라 A260과 280 사이의 흡광도 비를 사용하여 샘플내의 DNA 농도를 정량화한다.
시료의 DNA 농도를 마이크로리터당 50나노그램으로 조절하고, 수산화나트륨 8개를 추가로 사용하여 시료의 DNA 농도를 50나노그램으로 조정하고, GFP 태그의 실시간 PCR 검출을 위한 오픈 소스 프라이머 설계 웹 포털을 이용하여 외인성 녹색 GFP 서열에 특화된 프라이머 쌍을 설계하고 종양의 황실 부위를 대장산화한 전이성 세포를 검출한다. 그런 다음 샘플의 실시간 정량적 PCR 분석을 위해 빠른 실시간 PCR 프로토콜과 빠른 실시간 PCR 프로토콜을 지원하는 실시간 PCR 기계를 사용합니다. 폐에서 전이성 유방암 세포의 검출을 위해, 흉부 구멍을 열고 기관지를 드러내기 위하여 심혼과 흉선 과거를 잘라해 내는 가위를 사용하십시오.
부인 용액을 함유한 10밀리리터 주사기에 부착된 22게이지 바늘을 기관으로 삽입하고 붕괴된 폐가 용액의 약 2밀리리터로 부어질 때까지 플런저를 누를 수 있습니다. 폐가 팽창되면 주사기와 바늘을 제거하고 전체 폐를 신선한 부인 용액을 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전한 후 실온에서 24시간 동안 몸을 담그십시오.
다음 날, 물로 폐를 헹구고 샘플을 70 %의 에탄올 튜브에 넣습니다. 그런 다음 해부 현미경을 사용하여 폐 표면에 전이성 흰색 패치와 목절수를 계산합니다. 캘리퍼에 의한 종양 부피 측정은 치료 효능을 평가하기 위한 잘 확립된 방법입니다.
연구 그룹 간의 유사한 신호를 얻으려면 화상 진찰 전 BLI 운동학 연구를 수행하여 최적의 이미징 기간을 결정해야 합니다. 우수한 신호 대 배경 비로 인해 생체 내 BLI의 전신은 GFP 접근법에 비해 낮은 수준의 전이 신호를 검출하는 데 매우 민감합니다. 그러나, GFP 분자의 안정특성 때문에, 연구원은 이중 리포터 연구 결과에 있는 표적 기관에서 GFP 신호를 포착하기 전에 시체를 처리하는 충분한 시간이 있습니다.
이 실제 사례는 캘리퍼 종양 크기 측정이 어떻게 데이터 해석을 왜곡할 수 있는지 를 보여 주며, 이 제노이식은 여전히 큰 질량과 모양을 유지하면서 실행 가능한 종양 세포 함량의 대부분을 잃어버렸습니다. 실시간 PCR에 의한 분자 검출은 또한 인간 또는 설치류에 자연적으로 존재하지 않는 전감염된 GFP DNA 서열로 외인성 GFP DNA 시퀀싱을 사용하여 직교 유방암 모델에서 뇌 전이의 설득력 있는 증거를 제공할 수 있다. 이식 부위는 생리학적으로 해부학적으로 암 악성 종양과 관련이 있어야 합니다.
종양 유전자와 단백질 발현 은 1 차 및 말단 부위에서 평가될 수 있으며 전이성 세포는 추가 특성화를 위해 격리될 수 있다.
