Notre protocole surmonte la fenêtre d’imagerie par bioluminescence limitée en incluant une balise GFP qui facilite également la détection et la quantification de la micrométastase par analyse PCR. Étant donné que l’étiquette GFP contourne la fenêtre d’acquisition limitée de bioluminescence, plus de sujets peuvent être photographiés sans perte de signal et le potentiel de résultats faussement négatifs est limité. Cette étude sera utile aux chercheurs pour l’évaluation de l’efficacité thérapeutique des agents anticancéraux.
Cette méthodologie fournit un modèle utile pour les chercheurs intéressés par l’EMT, la résistance aux médicaments et les mécanismes des cellules souches cancéreuses liés au processus métastatique ainsi que pour le développement de médicaments anticancéraux. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, écouvillonnez la quatrième glande mammaire gauche avec de l’alcool et utilisez de fines forceps de dent de rat pour soulever légèrement la quatrième glande mammaire. S’assurer que la pointe est biseauté, insérer une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue d’un millilitre contenant 100 microlitres de mélange matricielle membranaire du sous-sol cellulaire et rétracter légèrement le piston pour s’assurer que l’aiguille ne contacte aucun vaisseau sanguin.
Pour des résultats comparatifs, le site d’injection de cellules de tumeur doit être cohérent parmi tous les animaux destinataires. Si aucun sang n’entre dans la seringue, injectez lentement tout le volume de solution dans la graisse mammaire. Une masse surélevée ronde apparaîtra sous la peau.
Attendez 10 à 15 secondes que la matrice membranaire du sous-sol durcisse avant d’enlever l’aiguille et de permettre à la xénogreffe de croître librement sans interruption pendant sept à dix jours avant d’effectuer une mesure de la taille de la tumeur. Ensuite, utilisez des étriers pour mesurer la taille de la xénogreffe chez toutes les souris et déterminer le volume tumoral en utilisant l’équation comme indiqué. Avant d’imaginer les animaux de l’étude, imagez trois souris porteuses de tumeurs supplémentaires pendant 40 minutes à intervalles de deux minutes en utilisant les paramètres indiqués pour obtenir la cinétique de la luciferine pour l’étude.
Utilisez le signal de bioluminescence mesuré par pic pour définir la fenêtre de temps optimale d’acquisition d’image pour tous les points de temps suivants. Pour effectuer l’imagerie métastase, couvrez la tumeur primaire avec une manche coupée à partir d’un gant noir et placez une souris anesthésiée dans le scanner, puis imagez le signal luciferin en utilisant les mêmes paramètres que ce qui vient de le démontrer avec le côté ventral de la souris face à la caméra pour l’imagerie de métastase pulmonaire et le côté dorsal de la souris face à la caméra pour l’imagerie de métastase cérébrale. À l’aide d’un scanner et d’un logiciel d’analyse de données, dessinez une région d’intérêt sur la zone d’image pour vous assurer que l’ensemble de l’organe d’intérêt est couvert afin de permettre l’évaluation de la charge métastatique et de quantifier la production de bioluminescence comme flux total et photons par seconde.
Immédiatement après la quantification du signal de bioluminescence, récoltez le cerveau et les tissus pulmonaires et rincez rapidement les organes dans PBS pour éliminer les taches de sang superficielles. Placez les organes sur une plaque de plastique noir à faible fluorescence automatique et transportez les échantillons à un scanner de fluorescence multispectrale équipé d’une capacité spectrale de désintoxication pour la détection du GFP. Pour acquérir des images gfp multispectrales des organes extraits, numérisez les organes de 500 à 720 nanomètres avec une taille d’étape de 10 nanomètres.
Pour obtenir le profil d’auto fluorescence des tissus, numérisez les organes excisés des souris témoins non injectées. En outre, image GFP tissus positifs tels que la tumeur primaire pour acquérir la fluorescence automatique mixte profil GFP. Traiter ces spectres selon le protocole du fabricant afin d’établir une bibliothèque spectrale avec des profils de GFP purs et de fluorescence automatique.
Après avoir confirmé l’exactitude de la bibliothèque spectrale et séparé le signal GFP de l’arrière-plan d’auto fluorescence tissulaire, utilisez la même bibliothèque pour démixer toutes les images à l’étude. Pour l’extraction de l’ADN après le gel instantané, placez le cerveau entier dans un tube homogénéisant de cinq millilitres contenant deux millilitres de tampon de lyse d’ADN et utilisez un homogénéisateur réglé à 50 pour homogénéiser le tissu. Lorsque le tissu a été entièrement homogénéisé, transférer un millilitre du lysate à un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres sans DNAse et RNAse et isoler l’ADN selon le protocole du fabricant.
Ajouter 500 microlitres de 100% d’éthanol à l’isolat et mélanger l’échantillon par inversion. Après trois minutes à température ambiante, utilisez une pipette pour transférer l’ADN en laine dans un nouveau tube sans DNAse et RNAse de deux millilitres. Laissez sécher l’air de l’échantillon pendant une minute avant d’ajouter un millilitre de 75 % d’éthanol au tube et d’inverser le tube trois à six fois pour laver l’échantillon.
Jetez l’éthanol après la dernière inversion avant de laver l’ADN deux fois de plus avec de l’éthanol frais par lavage comme nous venons de le démontrer. Après le dernier lavage, séchez l’échantillon pendant 10 secondes avant de dissoudre l’ADN dans 52 microlitres d’hydroxyde de sodium de huit millimlaires. Transférer un aliquot de deux microlitres d’ADN sur un flacon spectrophotomètre et quantifier la concentration d’ADN dans l’échantillon à l’aide d’un rapport d’absorption entre A260 et 280 selon la formule.
Ajuster la concentration d’ADN de l’échantillon à 50 nanogrammes par microlitre avec l’hydroxyde de sodium supplémentaire de huit millimolaires et concevoir la paire d’amorce spécifique à la séquence de GFP vert exogène en interne à l’aide d’un portail Web de conception d’amorce open-source pour la détection pcr en temps réel de l’étiquette GFP et les cellules métastatiques qui ont envahi et colonisé les sites distal de la tumeur. Ensuite, utilisez un réaccérateur PCR rapide en temps réel et une machine PCR en temps réel qui prend en charge un protocole PCR rapide en temps réel pour l’analyse quantitative en temps réel pcr de l’échantillon. Pour la détection des cellules métastatiques de cancer du sein dans le poumon, utilisez des ciseaux disséquants pour ouvrir la cavité thoracique et couper au-delà du cœur et du thymus pour exposer la trachée.
Insérer une aiguille de calibre 22 attachée à une seringue de 10 millilitres contenant la solution Bouin dans la trachée et déprimer le piston jusqu’à ce que les poumons effondrés deviennent gonflés avec environ deux millilitres de la solution. Retirer la seringue et l’aiguille une fois que les poumons ont été gonflés et transférer l’ensemble du poumon dans un tube de 15 millilitres contenant une solution Bouin fraîche. Inverser doucement le tube à quelques reprises avant de laisser tremper le tissu pendant 24 heures à température ambiante.
Le lendemain, rincer le poumon à l’eau et placer l’échantillon dans un tube de 70% d’éthanol. Ensuite, utilisez un microscope disséquant pour compter le nombre de taches blanches métastatiques et de nodules sur les surfaces des poumons. La mesure du volume tumoral par étrier est une méthode bien établie pour évaluer l’efficacité du traitement.
Pour obtenir des signaux comparables entre les groupes d’étude, une étude cinétique BLI de pré-imagerie doit être menée afin de déterminer le meilleur délai d’imagerie. En raison du rapport supérieur de signal-à-fond, le corps entier in vivo BLI est tout à fait sensible en détectant des signaux de métastase de bas niveau comparés à l’approche de GFP. Cependant, en raison de la nature stable de la molécule GFP, les chercheurs ont suffisamment de temps pour traiter la carcasse avant de capturer les signaux GFP à partir d’organes cibles dans le cadre d’études à double reporter.
Cet exemple de la vie réelle démontre comment les mesures de taille de tumeur d’étrier peuvent déformer l’interprétation de données pendant que cette xénogreffe a perdu la majeure partie de la teneur viable de cellules de tumeur tout en maintenant sa grande masse et forme. La détection moléculaire par PCR en temps réel peut également fournir des preuves convaincantes de métastase cérébrale dans le modèle orthotopique de cancer du sein utilisant le séquençage exogène d’ADN de GFP car la séquence transfectée d’ADN de GFP n’existe pas naturellement chez l’homme ou les rongeurs. Le site d’implantation doit être physiologiquement et anatomiquement lié à la malignité de cancer.
L’expression du gène tumoral et des protéines peut être évaluée à des emplacements primaires et distals et les cellules métastatiques peuvent être isolées pour une caractérisation plus approfondie.
