Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

Este protocolo descreve a técnica para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma primário e lesões de metástase pulmonar. Por injeção intratibiana de células osteossarcoma, este modelo imita melhor as características de desenvolvimento clínico do tumor osteossarcoma. Números precisos de células osteossarcoma são injetados diretamente na tíbia usando uma seringa de microvolume, permitindo taxas idênticas de formação de tumores e volumes tumorais.

No dia da injeção de células de osteossarcoma, lave as células duas vezes com PBS. Trypsinize as células com 1,5 mililitros de 0,25% de trippsina por três minutos. Em seguida, adicione seis mililitros de mídia MEM contendo 10% de soro.

Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Aspire 20 microliters de suspensão celular na câmara da placa de contagem celular, e calcule a concentração celular usando um contador automático de células. Centrifugar as células a 800 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente.

Aspire o supernasce com uma pipeta, resuspenda a pelota celular em uma matriz de membrana de porão de 8,5 miligramas por mililitro, e coloque-as no gelo. Coloque o mouse na posição supina. Segure o tornozelo do rato usando o polegar e o dedo indicador, e desinfete o local de injeção da tíbia com um cotonete de 70% de etanol.

Gire a articulação do tornozelo de cada rato para fora para mover a tíbia e a fíbula, e dobre a articulação do joelho para uma posição adequada até que o platô da tíbia proximal seja visível através da pele. Conecte a agulha a uma seringa de um mililitro e aponte a ponta da agulha em direção ao local da injeção, paralelamente ao eixo da tíbia. Insira percutâneamente a agulha para fazer um furo através da plataforma da tíbia em direção à extremidade distal da tíbia.

Carregue a suspensão da célula osteossarcoma previamente colocada no gelo em uma seringa de microvolume, e substitua a seringa de um mililitro na tíbia com a seringa microvolume carregada por célula de osteossarcoma. Injete lentamente aproximadamente 10 microliters de suspensão celular osteossarcoma na tíbia de cada camundongo atrímico sem aplicar muita pressão. Em seguida, remova a seringa de microvolume do local da injeção e pressione o local com o cotonete por cerca de 30 segundos.

Coloque o mouse de volta em uma gaiola limpa e observe sua recuperação por 10 minutos. Esta figura retrata o modelo do camundongo com osteossarcoma ortotópico desenvolvido a partir da injeção de célula osteossarcoma intratibial e sua forma isolada. Um aumento gradual no volume do tumor é observado a cada semana.

As imagens de raio-X obtidas da primeira à sexta semana após a injeção de células osteossarcoma rotuladas por luciferase mostraram um aumento gradual no volume. Além disso, a imagem obtida após a injeção na tíbia do camundongo mostrou crescimento ortotópico de osteossarcoma in vivo. A metástase pulmonar causada pela injeção intratibial das células osteossarcoma foi rastreada in vivo com sucesso usando um sistema de imagem ao vivo bioluminescência.

A observação sob um estereótipo revelou colônias metastáticas nos tecidos pulmonares isolados. A coloração em tecidos pulmonares embutidos na parafina mostrou lesões metastáticas. A agulha deve ser inserida percutâneamente na cápsula articular através do ligamento patelar para perfurar um buraco através da plataforma da tíbia em direção à tíbia digital girando a seringa.