Os autores gostariam de agradecer financiamento concedido pelo Programa de Alocação de Recursos UCSF.

Todo o trabalho animal foi realizada sob estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Califórnia, em San Francisco. 1. embrionárias de camundongos lacrimais Glândulas (LG): Colheita e Microdissection <ol><li> Seguindo os procedimentos aprovados pelos Animais institucionais para a comissão de Ética de Pesquisa Científica, eutanásia cronometrado CD-1 (ou transgênicos) fêmeas grávidas com o aumento da inalação de CO 2, seguido de confirmação por deslocamento cervical para colheita de embriões no dia embrionário adequado. Designar o dia da vaginal e0 ficha descoberta. Nota: glândulas lacrimais (LGS) podem ser colhidas a partir da e14 único broto fase em diante. No entanto, e16 (5-10 gomos) embriões dar os resultados mais consistentes para ex vivo da cultura. </li><li> Esterilizar a vlado entral do mouse usando etanol 70%. Aperte a pele e fazer uma incisão na linha média com tesouras cirúrgicas estéreis; cortar através da pele e do peritoneu para expor a cavidade abdominal. Retirar as duas trompas uterinas por corte ao longo da mesométrio no topo de cada trompa uterina e em lugar frio PBS (Tampão fosfato salino) ou meio DMEM F12 suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Utilizando uma pinça (# 5), remova os embriões dos sacos amniótico e coloque em uma segunda placa de Petri estéril contendo PBS frio. Tenha cuidado para não tocar os olhos ou a área da cabeça. </li><li> Coloque embrião em um microscópio de dissecação com uma base de transiluminação. Se o embrião é &lt;e17, execute os passos 1,5-1,7. Se os embriões são&gt; e17, estes passos podem ser úteis, mas não são essenciais, portanto, siga para o passo 1.8. </li><li> Cortar a cabeça do tronco imediatamente abaixo da mandíbula inferior (passo 1, Figura 2) usinga bisturi estéril (# 10 lâmina). Gire a cabeça para que a mandíbula está agora na placa de dissecação. Use uma pinça para estabilizar a cabeça e um bisturi para remover cerca de ¼ do lado dorsal do cérebro (passo 2, 1º corte, Figura 2) - isto é especialmente importante uma vez que a cartilagem endurece em torno e15. </li><li> Orientar a cabeça para que o bisturi pode furar o nariz entre os olhos. Fazer um corte através do centro da cabeça, de modo que os olhos estão agora em metades separadas (etapa 2, 2 nd corte, Figura 2). </li><li> Usando dois # 5 fórceps, tomar a metade da cabeça e retire o excesso de tecido (veja o passo 3, Figura 2). Certifique-se de orientar a cabeça para que a LG (localizado no canto inferior posterior do olho) não está perdido neste processo de remoção. Remover o excesso cerebral, cartilagem e tecido circundante nasal e abaixo do olho. Uma vez que a glândula é pouco visível neste momento, garantir o olho está devidamente orientado após o excesso de tecido remoção to evitar perder a localização da LG. </li><li> Cuidadosamente agarrar a pele do posterior, canto inferior do olho com as duas pinças. Retire a pele puxando cuidadosamente aberta com a pinça para expor a LG. Use iluminação adicional acima e abaixo do tecido para ajudar a visualizar o LG. Nota: A LG, distinguível por sua aparência como um botão em um duto dentro, um mesênquima condensado mais escuro, deve ser visível neste momento. </li><li> Cuidadosamente começam a dissecar a LG e mesênquima associado (veja o esquema e imagens) de distância do tecido circundante usando uma pinça, tomando cuidado para não pegar a LG ou a sua conduta de associado. Uma vez que a glândula está livre a partir do tecido circundante, remover cuidadosamente toda a glândula agarrando o epitélio circundante do olho na base da conduta de LG. Ter o cuidado de preservar a mesênquima em torno do epitélio, o que pode ser observado como um mesênquima condensada em que os invagina epitélio. NOTA: Algumas remoção adicional de tissue (quaisquer pequenos fragmentos de osso, músculo e tecido conjuntivo) pode ser necessário para evitar factores de sinalização / crescimento do tecido vizinho. </li><li> Para a cultura, a colheita 4-5 glândulas e mesênquima associado por placa (GL são banhados imediatamente após a dissecção); recolher um mínimo de 14 glândulas por 100 ul de tampão de lise de ARN para RT-PCR 6. </li></ol> 2. preparar as placas para Ex Cultura vivo Este procedimento é baseado no sistema utilizado para o desenvolvimento da glândula salivar 7,8. <ol><li> Adicionar 200 ul de DMEM F12 (suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina), meios de cultura com 50 ug / ml de ácido ascórbico e 50 ug / mL de holo-transferrina a um micropoço 50 milímetros de diâmetro prato de vidro de fundo 7. Nota: DMEM F12 foi escolhido como nós anteriormente achei que maximizar morfogênese na glândula salivar embrionário. </li><li> Flutuar um polycarb 13 milímetrosfiltro de membrana onate com 0,1 mm poros no topo da mídia. </li><li> Passo opcional: Diluir 3-D laminina 1: 1 com DMEM / F12 para fazer uma concentração final de 3 mg / ml (200 ul usar pipeta para misturar suavemente; centrifugar durante 1 min, se aparecerem bolhas). Adicionar 15 ul desta diluída laminina 3-D para filtrar. Nota: Esta diluição foi encontrado para ser óptima para a manutenção da LG no seu estado 3D sem comprometer a ramificação do epitélio. No entanto, não é essencial para a cultura de LG. </li><li> Colocar 4-5 LG para um filtro ou em laminina. Cultura GL ex vivo para 24-48 hr (Figura 3) ou fixar com PFA a 4% durante 20 min, para posterior análise por qPCR ou imunocoloração (Figura 4). Para a análise de qPCR de tecido glandular embrionário, consulte Rebustini et al., 2011. Para a análise de imunofluorescência de tecidos glandulares embrionárias, por favor consulte as seguintes citações: Hoffman et al, (2002) e Steinberg e.t al., (2005). </li></ol> 3. Rato pós-natal e Adultos lacrimais Glândulas (LG): Dissection <ol><li> Euthanize o mouse pós-natal de acordo com os padrões adequados da comissão ética animal. Para filhotes pós-natais dia 8 ou mais jovens, eutanásia, cortando a cabeça com uma tesoura esterilizada. Para o dia pós-natal 8 anos ou mais, spray de pele com etanol 70%. </li><li> Para localizar a LG, coloque o mouse laterais lado sob um microscópio de dissecação com iluminação de cima. Nota: O LG pós-natal e adulto estão cercados pela artéria carótida, o músculo masseter e da derme (ver Figura 5). </li><li> Com uma tesoura pequena de dissecação, fazer pequena incisão na epiderme lateralmente de onde a LG deve ser localizado. </li><li> Utilizando uma pinça, abra a epiderme em direção à orelha para expor a LG. </li><li> Use uma pinça para soltar suavemente LG do tecido circundante. </li><li> Uma vez que a LG é liberado do tecido circundante, retire cuidadosamente a LG pelo duto,por onde agarrar a conduta e o epitélio circundante do olho conectar (Figura 1). </li><li> Colocar GL em tampão de lise de ARN para RT-PCR, ou fixar com PFA a 4% durante 20 min para imunocoloração. </li></ol>

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	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A versatilidade de cultura e manipular o LG ex vivo proporciona vantagens significativas para estudar o seu desenvolvimento. Isto inclui a velocidade a que o pesquisador é capaz de testar hipóteses e a multiplicidade de perturbações que podem ser realizados para avaliar a forma como epitelial, neuronais, células endoteliais e mesencyhmal interagem para formar o órgão. No entanto, há um número de advertências para a utilização deste modelo. Em primeiro lugar, em virtude de seu isolamento a glândula ...

A glândula lacrimal (LG) é responsável pela secreção de lágrima aquosa crítica para a acuidade visual e a saúde, a manutenção e a protecção das células da superfície ocular. LG resultados disfunção em um dos distúrbios oculares mais comuns e debilitantes: doença de olho seco deficiente aquosa, o qual é caracterizado por irritação ocular, sensibilidade à luz e uma visão diminuída. No ser humano o LG reside na órbita acima da extremidade lateral do olho onde 3-5 excretores lágrimas condutas de depósito sobre a superfície ocular. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido (exorbital) com lágrimas que viajam para o olho através de um único canal excretor. Semelhante a outros órgãos glandulares, a LG desenvolve através do processo de morfogênese epitelial ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensado passa por várias rodadas de broto e formação de duto para asou uma intrincada rede interligada de ácinos e ductos de secreção (Figura 1) 2. Durante o desenvolvimento do epitélio torna-se vascularizado, bem como fortemente inervados por nervos parassimpáticos do gânglio pterigopalatina e, em menor grau pelos nervos simpáticos do gânglio cervical superior 3. As interacções entre as células de cada um destes tipos de células neuronais ou seja, epiteliais, endoteliais e mesenquimais, são essenciais para a função e manutenção do tecido adulto. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes coordenação LG desenvolvimento e regeneração, bem como a forma como tipo de comunicação inter-celular orienta esses processos ainda não está claro. O advento das embrionárias ex vivo técnicas de cultura permitiu a identificação de vias de desenvolvimento e regeneração em vários órgãos de ramificação 4. A cultura ex vivo dá o pesquisador a capacidade de manipular o órgão (memecânica, química ou genética) sob condições definidas, bem como para caracterizar o desenvolvimento de órgãos e as interacções célula-célula em tempo real. A LG exorbital do mouse é altamente favorável a esta técnica e estudos recentes têm definido sistemas que regulam seu desenvolvimento 2,5 sinalização. No entanto, apesar da necessidade de entender sinais moleculares subjacentes LG desenvolvimento e regeneração, que atualmente permanece pouco estudado, provavelmente devido às dificuldades técnicas de isolamento do órgão. Neste artigo, descrevemos como isolar e executar ex vivo da cultura do embrionário murino LG para definir programas de desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 without HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Albumin solution from bovine serum</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% Solution</td><td>15710</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Diluted to 4% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x</td><td></td><td></td><td>Prepared from 10x stock</td></tr><tr><td>holo-Transferrin bovine</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>Stereo Microscope with substage iluminator</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td></tr><tr><td>Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&amp;nbsp;mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>50 mm uncoated glass bottom dishes</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Widefield fluorescence microscope</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td></tr><tr><td>SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2&amp;nbsp;cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td></tr><tr><td>Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11&amp;nbsp;cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td><td>Ideal for harvesting glands from embryos.</td></tr><tr><td>Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1&amp;nbsp;&amp;mu;m pore size, 13&amp;nbsp;mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td></tr></tbody></table>

manipulating the murine lacrimal gland

A glândula lacrimal (LG) segrega lágrimas aquosas necessárias para a manutenção da estrutura e função da córnea, um tecido transparente essencial para a visão. No ser humano uma única LG reside na órbita acima da extremidade lateral de cada olho entregar lágrimas para a superfície ocular através de 3-5 condutas. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal exorbital (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido. Semelhante a outros órgãos glandulares, o LG desenvolve através do processo de epitelial morfogénese de ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensada é submetido a vários ciclos de gema e formação adesiva para formar uma intrincada rede interligada de ácinos secretora e condutas. Este processo elaborado tem sido bem documentado em muitos outros órgãos epiteliais, tais como o pâncreas e glândulas salivares. No entanto, a LG tem sido muito menos explorado e os mecanismos que controlam a morfogênese são mal sobse levantou. Suspeitamos que essa sub-representação como um sistema modelo é uma conseqüência das dificuldades associadas com a descoberta, dissecando e cultivando a LG. Assim, aqui descrevemos técnicas de dissecação para a colheita embrionário e pós-natal LG e métodos para a ex vivo da cultura do tecido.

O LG desenvolve através do processo de ramificação epitelial morfogénese. Imagens de campo claro de GL embrionárias dissecados em e14, e15, e16, e17, e P2 ilustrar este evento. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. A LG desenvolve através do processo de ramificação morfogênese epitelial. Imagens de campo claro de GL embrionárias recentemente...

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Manipulating the Murine Lacrimal Gland

A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento.

Manipulando o Murino lacrimais Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

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Biology

20.8K visualizações.  University of California San Francisco.  A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento. 

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A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

Um modelo de coelho da doença aquosa-deficiente do olho seco induzida pela concanavalina Uma injeção nas glândulas lacrimal: aplicação a estudos de eficácia de drogas

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Medicina

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Biologia

Disfunção da glândula lacrimal induzida por escopolamina em ratos

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal tear production can lead to a disturbance in the ocular surface environment, including corneal damage and inflammation. In severe cases, ADDE can cause vision loss or even blindness. Currently, dry eye treatment is limited to eye drops or physical therapy, which can only alleviate eye discomfort symptoms and cannot fundamentally cure dry eye syndrome. To restore the function of the lacrimal gland in dry eye, we have created an animal model of lacrimal gland dysfunction in rats induced by scopolamine. Through the comprehensive evaluation of the lacrimal gland, corneas, conjunctivas, and other factors, we aim to provide a full understanding of the pathological changes of ADDE. Compared with the current dry eye mouse model, this ADDE animal model includes a functional evaluation of the lacrimal gland, providing a better platform for studying lacrimal gland dysfunction in ADDE.

Autor em destaque: Desafios no desenvolvimento de modelos animais de olho seco e futuras direções de pesquisa

Here, we establish a rat model of lacrimal gland dysfunction to provide a basis for the study of aqueous-deficient dry eye.

Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its underlying mechanisms. Therefore, we developed a mouse model of dry eye disease by surgically removing both the extraorbital lacrimal glands (ELG) and intraorbital lacrimal glands (ILG) to investigate the ocular surface pathology in the context of aqueous deficiency dry eye. Two weeks post operation, the mice exhibited severe dry eye manifestations, including reduced tear secretion, corneal epithelial irregularities, positive fluorescein sodium staining, and neovascularization. Histological examination via hematoxylin and eosin staining revealed inflammatory cell infiltration and corneal epithelium dysplasia. Immunofluorescence staining and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction revealed decreased expression of the normal corneal epithelial biomarkers K12 and Pax6 and increased expression of Sprr1b in the corneal epithelium. These ocular manifestations indicated abnormal corneal epithelial differentiation. Furthermore, immunofluorescence staining of Ki67 revealed the increasing cell proliferation. In conclusion, the ELG plus ILG excision model proved suitable for studying changes in the ocular surface and elucidating the mechanisms underlying aqueous deficiency dry eye.

Here, we present a method to establish a mouse model of aqueous-deficient dry eye by excising the extraorbital and infraorbital lacrimal glands and evaluate the changes in the ocular surface in aqueous deficiency dry eye.

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from desiccation stress and external insults. Little is known about lacrimal gland (patho)physiology because of the lack of adequate in vitro models. Organoid technology has proven itself as a useful experimental platform for multiple organs. Here, we share a protocol to establish and maintain mouse and human lacrimal gland organoids starting from lacrimal gland biopsies. By modifying the culture conditions, we enhance lacrimal gland organoid functionality. Organoid functionality can be probed through a "crying" assay, which involves exposing the lacrimal gland organoids to selected neurotransmitters to trigger tear release in their lumen. We explain how to image and quantify this phenomenon. To investigate the role of genes of interest in lacrimal gland homeostasis, these can be genetically modified. We thoroughly describe how to genetically modify lacrimal gland organoids using base editors-from guide RNA design to organoid clone genotyping. Lastly, we show how to probe the regenerative potential of human lacrimal gland organoids by orthotopic implantation in the mouse. Together, this comprehensive toolset provides resources to use mouse and human lacrimal gland organoids to study lacrimal gland (patho)physiology.

This protocol describes how to establish, maintain, genetically modify, differentiate, functionally characterize, and transplant lacrimal gland organoids derived from primary mouse and human tissue.

Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Superior Lacrimal Gland Removal: A Surgical Technique to Remove the Palpebral and Orbital Parts of Superior Lacrimal Gland from Rabbit Model

Source: Honkanen, R. A. et al., <a href="https://www.jove.com/v/60126">Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the surgical procedure to remove the two parts: palpebral and orbital of the superior lacrimal gland from a rabbit to create a dry eye disease model. This rabbit model is suitable for studies of ocular surface homeostasis, pathophysiology and ocular therapeutics.

Remoção da glândula lacrimal superior: uma técnica cirúrgica para remover as partes palpebral e orbital da glândula lacrimal superior do modelo de coelho

Source: Honkanen, R. A. et al., Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (2020).
This video ...

Manipulando o Murino lacrimais Gland

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Um modelo de coelho da doença aquosa-deficiente do olho seco induzida pela concanavalina Uma injeção nas glândulas lacrimal: aplicação a estudos de eficácia de drogas

Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos

Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

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Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

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