Este é um protocolo simples para a síntese de nanoclusters de ouro emissores de fogos de ouro fotoluminescente funcionalizáveis e quase infravermelhos e sua detecção usando uma configuração comercial. Uma das principais vantagens desta técnica é que o apego do ligante funcionalizado por tiol e o acoplamento de ligantes funcionalizados amina na superfície dos nanoglomerados de ouro não afetam negativamente as propriedades fotoluminescentes e a estabilidade da bobina. Pode-se prever que a combinação de intensas propriedades de fotoluminescência e conjugação com biomoléculas permitirá a detecção in vitro de anilides de baixa concentração, biosensamento, solublingagem e bioimagem.
Demonstrando o procedimento será Klaudia Kvakova, minha aluna de doutorado. A citometria de fluxo será demonstrada pela assistente de pesquisa Alzbeta Magdolenova. A parte microscópica será demonstrada por Vaclav Bocan, um estudante de pós-graduação do Laboratório Lenka Libusova.
Comece adicionando 7,8 miligramas de ácido tiotético em 60 microliters de hidróxido de sódio de dois molares a 23,4 mililitros de água ultrapura e mexendo a mistura até dissolver completamente. Em seguida, adicione 10,2 microlitradores de tetraclorato de hidrogênio à solução e, após 15 minutos, adicione 480 microliters de boroidido de sódio recém-preparado enquanto mexe vigorosamente. Continue mexendo a mistura de reação durante a noite.
No dia seguinte, purifique a solução usando três ciclos de ultrafiltração com um corte de peso molecular de três kilodaltons, em seguida, adicione 15,6 miligramas de glicol de polietileno com hipofite terminada à solução, ajuste o pH para entre 7 e 7,5, e mexa a mistura durante a noite para obter nanocluster 1. No dia seguinte, repita os três ciclos de centrifugação e filtragem para purificar a dispersão. Misture a solução de nanoaglomerado 1 com TPP e, em seguida, ajuste o pH para 4,5 com cloreto de hidrogênio de um molar.
Inicie a reação adicionando um excesso de HCL EDC e monitore o pH da mistura durante a primeira hora. Se o pH aumentar acima de seis, reduza-o adicionando cloreto de hidrogênio. Mexa a mistura de reação durante a noite à temperatura ambiente.
No dia seguinte, realize três ciclos de centrifugação e filtragem como descrito anteriormente para obter nanocluster 2. Diluir 2 com água ultrauso a um volume de 24 mililitros. Seme as células em uma placa de 12 poços a uma densidade de 20.000 células por poço.
Incuba-os por 48 horas, depois aspire o meio e adicione 400 microliters de meio de cultura completa com ou sem 500 microgramas de nanopartículas por poço. Retorne as células à incubadora Celsius de 37 graus para internalização de nanoglomerados. Após duas horas, desprende as células com trippsinização padrão.
Colete-os em tubos de microcentrífugo de polipropileno e centrífuga por cinco minutos a 350 vezes g e quatro graus Celsius. Prepare o buffer FCM de acordo com as instruções do manuscrito e use um mililitro do buffer para lavar as pelotas celulares. Centrifugar as células por mais cinco minutos, depois resuspensá-las em 500 microliters do buffer FCM e armazená-las a quatro graus Celsius.
Antes da aquisição da amostra, certifique-se de que o instrumento tenha a configuração óptica correspondente. Coloque o filtro 780 sobre 60 bandpass em frente ao detector 405A. Filtre todas as amostras usando um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros com uma tampa de coador celular.
Especifique a configuração do cítômetro. Plote um gráfico de dois parâmetros de pontos do FSC-A e SSC-A para mostrar a distribuição das células. Para excluir os duplos, crie um gráfico de ponto de dois parâmetros de FSC-H versus FSC-A e plote um histograma de um único parâmetro para a área do canal fluorescente para monitorar a intensidade relativa da fluorescência na amostra.
Adquira amostra não tratada a uma baixa taxa de fluxo para minimizar eventos coincidentes. Durante a aquisição, ajuste as tensões pmt para obter a população não tratada em escala no lote FSC versus SSC. Se necessário, ajuste as tensões pmt para o canal FL para colocar a população não manchada no canto esquerdo do histograma.
Em seguida, selecione a guia gate específica no software e desenhe um portão apropriado em torno da população desejada. As células dentro do portão se moverão para o próximo posto de controle. Configure o experimento e regise os dados.
Às 24 horas após a semeadura, adicione 100 microgramas de 2 a cada câmara de prato contendo 0,5 mililitros de médio com células HeLa. Devolva o prato para a incubadora e permita que as células internalizem os nanoaglomerados, depois descartem o meio e lavem as células com meio pré-armado e fresco. Encha cada câmara com 800 microliters de meio fresco e proceda com imagens.
Para imaginar as células, use um microscópio confocal com Plan-APOCHROMAT e uma lente objetiva de óleo de 63x. Monte o prato no palco invertido com a câmara aquecida até 37 graus Celsius e fornecida com uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono. Detecte nanoaglomerados de ouro internalizados usando um conjunto laser de 405 nanômetros para 2% de potência com um divisor de feixe apropriado, definindo a faixa de comprimentos de onda de detecção entre 650 e 760 nanômetros.
Defina a resolução da imagem para 2048 em 2048 pixels. Na configuração de velocidade de aquisição, aponte para um tempo de habitação de pixels em torno de quatro microssegundos e adquira a imagem com duas vezes a média, em seguida, ajuste o pinhole para uma unidade de área e, para maior sensibilidade, use o modo de contagem de fótons. Para a iluminação correta e a luz transmitida com DIC use a configuração kohler do condensador e parada de campo.
Para adquirir luz transmitida, use um laser de 488 nanômetros com 0,7% de potência sem qualquer detector de fluorescência atribuído, certificando-se de definir um divisor de feixe apropriado para o comprimento de onda laser. Os espectros de absorção indicaram que os nanoaglomerados de ouro 1 e 2 não têm uma banda de plasmon superficial característica e mostram uma ampla emissão de 550 a 850 nanômetros. A fotoluminescência aumentou fortemente após a fixação do TPP à superfície de 1.
A emissão dos nanoaglomerados também foi visível sob uma luz UV de 365 nanômetros. A emissão era estável e seu comprimento de onda era independente do comprimento de onda de excitação, mas a intensidade era máxima quando excitada com luz UV. A citometria de fluxo foi usada para confirmar a absorção de nanocluster 2 por células HeLa.
A fluorescência próxima dependia tanto do tempo de incubação quanto da concentração do nanoaglomerado 2. Os nanoaglomerados de ouro dentro das células foram imagens não invasivamente com um microscópio de varredura a laser confocal padrão. As células foram manchadas com nanocluster 2 e, após 24 horas de incubação, foi observada fotoluminescência vermelha brilhante dentro das células.
Ao tentar este protocolo, é importante lembrar que a remoção de boroidridido de sódio não redigido e hidrolisado é muito importante, caso contrário, o polietileno glicol tioolado não se ligará à superfície do nanoaglomerado de ouro. Além disso, a fotoluminescência dos nanoaglomerados de ouro começa a partir de 560 nanômetros. Para evitar a autofluorescente de fundo em experimentos de microscopia confocal, os fótons devem ser coletados acima de 650 nanômetros.
