Este método é significativo porque os organoides derivados do paciente fornecem uma ferramenta rápida e poderosa para estudar câncer urológico, pois eles frequentemente imitam a heterogeneidade genética e fenotípica desta doença multispectrum. Os organoides podem ser isolados de uma quantidade limitada de material de biópsia do paciente e podem ser rapidamente expandidos para análise a jusante. Os organoides gerados usando este protocolo podem ser usados tanto como modelos para nos ajudar a entender a base celular e molecular dos cânceres urológicos quanto como ferramentas de medicina de precisão para nos permitir prever quais tratamentos e pacientes individuais o câncer pode responder.
Para começar, colete uma nova amostra de tumor macroscopicamente viável da cirurgia e certifique-se de que a amostra esteja submersa em meio de transporte em um tubo cônico estéril de 50 mililitros ou frasco de amostra de urina durante o trânsito. Registos da amostra, incluindo peso tecidual, descrição da amostra e detalhes sobre quaisquer amostras de sangue e urina na folha de processamento da amostra do paciente. Substitua cuidadosamente o meio de transporte por 10 mililitros de mídia basal e permita que o tecido tumoral se instale pela gravidade.
Em seguida, usando fórceps, remova o tecido tumoral e coloque-o em uma placa de Petri estéril de 90 milímetros. Regisso o peso do tecido em gramas ou miligramas na folha de processamento da amostra clínica e na grade de dissecção. Em seguida, usando fórceps estéreis em uma lâmina de bisturi descartável montada em uma alça de bisturi, remova o tecido não canceroso e regiões necrosadas macroscópicas visíveis.
Lave as peças tumorais uma ou duas vezes com DPBS frios, depois colete e transfira-as para uma nova placa de Petri estéril de 90 milímetros. Tire uma foto, desenhe um diagrama de tecido e planeje a dissecção tecidual em uma grade de processamento clínico. Para análise histopatológica, coloque aproximadamente 50 miligramas do tecido tumoral em um de histologia de plástico descartável rotulado.
Em seguida, submergir o de histologia em um recipiente com volume de 5X a 10X de formalina tamponada 10% neutra e incubar durante a noite. No dia seguinte, substitua a formalina por 70% de etanol para armazenamento a quatro graus Celsius até que o tecido possa ser processado. Para análise molecular, congele pelo menos uma peça tumoral em um RNase, DNase livre 1,5 mililitro criovial usando nitrogênio líquido e armazenar a menos 80 graus Celsius.
Em seguida, dispense cinco mililitros de meio organoide na placa de Petri de 90 milímetros contendo as peças tumorais restantes e mecanicamente pique o tecido o mais fino possível. usando uma lâmina de bisturi estéril de 10. Transfira o tecido finamente picado para um tubo cônico de 50 mililitros e adicione quatro mililitros de meio organoide, um mililitro de colagenase/hialuronidase de 10X e 0,1 miligrama por mililitro DNase I para evitar a aglomeração celular.
Incubar o tecido tumoral picado em solução enzimática por uma a duas horas em um agitador orbital ou rotador em uma incubadora para dissociar fragmentos em uma suspensão celular e quebrar collagens. Em seguida, pare a digestão adicionando o dobro do volume do meio basal à amostra. Centrifugar a amostra, aspirar e descartar o supernatante.
Em seguida, para contaminar os glóbulos vermelhos, resuspenque a pelota em cinco mililitros de tampão de potássio de cloreto de amônio e incubar o tubo à temperatura ambiente por três minutos ou até que a lise completa dos glóbulos vermelhos seja vista. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio basal no tubo. Centrifugar novamente e aspirar o supernaspe.
Nesta etapa, coloque uma alíquota de 10 mililitros de 2X e 1X meio organoide em um banho de água de 37 graus Celsius para aquecer. Filtre a amostra primeiro através de um coador reversível pré-molhado de 100 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros para remover um grande material insolúvel. Em seguida, filtrar o elto através de um coador reversível pré-molhado de 37 mícrons para coletar células únicas em pequenos aglomerados para isolamento de células únicas e imunes.
Em seguida, inverta o coador de 37 mícrons e adicione 10 mililitros de mídia basal para coletar pequenos e moderados clusters. Cubra cada um desses novos tubos de 50 mililitros com DPBS a 40 mililitros, depois centrifufique a suspensão e descarte o supernatante. Em seguida, adicione 10 mililitros de mídia basal ao tubo contendo as células únicas e conte as células usando corante de exclusão azul trypan em um contador celular automatizado.
Determine o número do celular e a viabilidade das células. Centrifugar a amostra restante e substituir o meio por solução de congelamento celular ou mídia basal contendo soro bovino 1%penicilina e estreptomicina e 10% DMSO, em seguida, coloque as amostras em criovias de 1,5 mililitro, armazene-as em um recipiente de autoconscimento e transfise imediatamente os recipientes para um freezer de menos 80 graus Celsius. No dia seguinte, transfira os criovials para armazenamento de fases de líquido criogênico ou de ar para armazenamento a longo prazo.
Em seguida, resuspenque os aglomerados de pequeno e moderado coletados com 500 microliters de meio organoide 2X pré-aquecido. Em seguida, com as pontas de pipeta de filtro estéril P-1000 estéreis, adicione BME às células e misture delicadamente. De forma rápida e cuidadosa pipeta 100 microliters das células reconstituídas mistura BME a poços de um acessório ultra baixo, placa de fundo plano 96-bem, e colocar a placa em uma incubadora por 20 a 30 minutos para solidificar.
Após a incubação adicione meio organoide em cima da suspensão da célula BME em uma proporção de um a dois, dependendo do volume avaliado empiricamente, e coloque a placa em uma incubadora por 20 minutos para equilibrar. Após a incubação, remova a placa da incubadora e monte-a em um porta-espécimes no estágio de um microscópio para avaliar organoides visualmente sob contraste de fase ou configurações de campo brilhante. Cubra o meio a cada dois ou três dias usando 50 microliters de meio organoide pré-aquecido para repor fatores de crescimento esgotados e volume geral.
Adquira as imagens da série time-lapse nos dias 1, 2 e 3, e 5, 7 e 10 antes da passagem. A digestão de duas horas de tecido de câncer de bexiga com colagenase/hyaluronidase e DNase I leva à digestão suficiente de 0,5 a 1 milímetros de pedaços cúbicos de tecido de biópsia de cistectomia mais complexa, incluindo as células neoplásicas dentro da propria lamina e camadas musculares da bexiga. Fragmentos maiores pós-digestão são adequados para placas de cultura e cultura de tecido padrão de qualquer tamanho para isolar novas culturas bidimensionais.
Os organoides gerados por este procedimento passam por uma automontagem dinâmica, incluindo fases de agregação, compactação e formação final de estruturas celulares apertadas. Histologicamente, essas estruturas recapitulam o tumor original do paciente. Os organoides gerados neste procedimento são adequados para muitos propósitos, incluindo caracterização histopatológica, biobanco e testes de eficácia de medicamentos.
Após a geração de organoides, métodos adicionais podem ser usados para traçar o perfil desses tumores, incluindo o papel de terapias anticâncgenas, perfil metabólico ou perfil de transcrição. Dentro desta estrutura 3D, essas metodologias adicionais fornecem uma visão poderosa da biologia do câncer de bexiga. Este método foi uma base importante para estudos que investigam a imunooncologia e o metabolismo celular.
