O que apresentamos aqui é um método robusto e simples para analisar a dinâmica dos microtúbulos usando imagens confocal de disco giratório em células sincronizadas em prometaphase, e as imagens são posteriormente analisadas em uma plataforma baseada em MATLAB. O uso de proteína fluorescente deslocada para vermelho em combinação com microscopia de disco giratório reduz a fototoxicidade. Portanto, um número maior de células pode ser imagens dentro da mesma preparação.
A dinâmica dos microtúbulos é alterada em um grande número de condições patológicas. Portanto, compreender a regulação e o comportamento da dinâmica dos microtúbulos nesses processos pode nos ajudar a entender o mecanismo da doença e, eventualmente, desenvolver terapias para compensá-las. E o método também é dimensionável, por isso poderia potencialmente ser aplicado em um esforço de descoberta de drogas.
O método pode ser modificado alterando o protocolo de desincronização da fluorescência e obtendo células de diferentes fases do ciclo celular. Isso pode ser útil ao triagem de drogas contra microtúbulos e identificação de defeitos na divisão e células não-divisórias. É necessário otimizar o protocolo de transfecção e a densidade de semeadura para cada tipo de célula.
O nível de expressão do EB3 deve ser baixo, a fim de detectar microtúbulos de crescimento único. Comece enxaguando assincronicamente o crescimento de células HeLa em DPBS, depois incuba-as com trypsin-EDTA por cinco minutos, a 37 graus Celsius. Pare a trippsinização adicionando RPMI-1640 médio suplementado com FCS inativado de 10% de calor em uma proporção de três para um, o trypsin-EDTA adicionado.
Calcule a concentração das células de acordo com as instruções do manuscrito, e sementes 50.000 células em cada poço de um talão de cobertura preparada e câmara. Devolva a tampa para a incubadora, e cresça células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova as células da incubadora e adicione 100 microliters de mistura de transfecção em cada poço.
Devolva as células à incubadora e, após quatro horas de incubação, suplemente as células com meio fresco e, adicionalmente, incubam por 20 horas. Prepare uma solução de 2,5 micromolar de dimetilenastron, ou DME, em DMEM livre de fenol vermelho, complementada com 10% FCS e dois milimônios L-glutamina. Substitua o meio de crescimento no deslizamento de coberturas câmaradas pelo meio de crescimento DME e devolva as células à incubadora.
Após 3,5 horas de incubação, transfira as células para o microscópio montando o deslizamento de coberturas câmara em uma câmara ambiental fixada em 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, com painéis escuros para imagem. Em seguida, continue a incubação por um total de quatro horas. Execute a imagem de lapso de tempo em um microscópio invertido com uma abertura numérica de 100X, 1,49, objetivo de imersão de óleo, um sistema confocal de disco duplo e um sistema de foco automático confiável.
Defina os parâmetros de imagem descritos no manuscrito do texto. Encontre uma célula em prophase, e concentre-se no plano Z correspondente ao centro do fuso mitotístico monopolar. Em seguida, adquira imagens a cada 5 segundos, ao longo de um total de um minuto, sem binning e sem iluminação entre as exposições.
Comece carregando o software de análise numérica e adicionando a pasta U-track V2.2.0 no caminho de pesquisa de software, chamado gui seletor de filme, da janela de comando. Em seguida, importe os arquivos brutos gerados pelo software de aquisição de imagens. Digite manualmente a abertura numérica do objetivo e o intervalo de tempo utilizado para a imagem.
Uma vez que todas as imagens são carregadas, salve a série de lapso de tempo inserida como um filme selecionando salvar como lista de filme e a opção u-track no lado direito da janela de diálogo. Selecione os plus-ends do microtúbulo do menu pop-up e clique em ok, que abre uma nova janela de diálogo para determinar os parâmetros das três etapas da análise. Para a primeira etapa, clique em configurações e selecione a detecção de cometas no menu suspenso.
Defina os parâmetros para a diferença do filtro gaussiano e a segmentação da bacia hidrográfica, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, selecione aplicar configurações a todos os filmes e clique em aplicar. Para a segunda etapa, selecione a dinâmica plus-end do microtúbulo e use as opções de configuração para definir os valores para vinculação, fechamento de lacunas, fusão e divisão e funções de filtro Kalman, de acordo com o manuscrito do texto.
Para problemas com dimensionalidade, escolha dois do menu suspenso e use cinco quadros para fechar a lacuna máxima e três quadros para o comprimento mínimo dos segmentos de faixa a partir da primeira etapa. Como antes, selecione aplicar configurações a todos os filmes e clique em aplicar. Para a terceira etapa, escolha a classificação de dinâmica de microtúbulos como método de análise de faixa e defina os parâmetros através do botão de configuração.
Selecione as caixas para remover faixas no início e no final do filme e faça histogramas estatísticos. Da lista de queda, selecione usando dois a três quadros antes da lacuna dianteira e 95º percentil de distribuição de velocidade de lacuna para a frente, para reclassificação para frente e para trás, respectivamente. Uma vez definidos todos os parâmetros, selecione aplicar verificação/desmarcação para todos os filmes e execute todas as caixas de filmes a partir da janela de faixa de controle e, em seguida, pressione a execução.
Uma mensagem é exibida assim que o processamento do filme estiver concluído. O plasmídeo pEB3-tdTomato foi transitavelmente expresso em células HeLa. As células foram sincronizadas com o tratamento DME.
Foram analisados filmes de lapso de tempo de crescimento de microtúbulos, e a velocidade de crescimento e a dinâmica resultantes foram traçadas. Os parâmetros descritos para afetar a análise, como o comprimento máximo de gap e o fator máximo de encolhimento, foram modificados para o mesmo conjunto de filmes de lapso de tempo. Foram calculados os valores correspondentes de velocidade e dinâmica de crescimento.
Embora a velocidade de crescimento resultante não tenha sido significativamente afetada, a dinâmica foi diferente quando o comprimento máximo da lacuna foi modificado. Nos três casos, a detecção de microclúbulos foi semelhante, mas a reconstrução das trajetórias completas de MT foi afetada principalmente quando o comprimento máximo do gap foi definido para 15. Para avaliar se as condições de imagem interferiram no comportamento dos microtúbulos, a primeira e a segunda metades da série de lapsos de tempo foram analisadas separadamente, e a velocidade e dinâmica de crescimento correspondentes foram comparadas.
Como esperado, não foram detectadas diferenças significativas. É importante ter em mente que, como as células são sincronizadas em prometaphase, a densidade do microtúbulo é muito alta. Portanto, é preciso definir os parâmetros da análise com muito cuidado, para não identificar mal os diferentes microtúbulos.
A medição da dinâmica dos microtúbulos com este método pode ser comparada com estudos de outros alvos biológicos direta, indiretamente, regulando microtúbulos.
