A imagem celular viva permite a observação de processos celulares dinâmicos ao longo do tempo dentro de uma única célula. Essas abordagens são poderosas para avaliar as condições que impactam o processo dinâmico de divisão celular e revelar os impactos que os defeitos na mitose têm na proliferação e viabilidade celular da filha. A fototoxicidade resultante da exposição à luz durante a imagem representa um desafio significativo associado a este protocolo.
Portanto, os tempos de exposição e o intervalo e duração da imagem devem ser otimizados. Utilizando técnica asséptica e um armário de segurança de nível dois de biossegurança, use uma pipeta pasteur descartável estéril para aspirar o meio da placa de cultura contendo a linha celular carregando a construção de expressão de interesse. Lave brevemente as células com 10 mililitros de PBS estéreis com redemoinho e trate as células com dois mililitros de 0,05% de trippsina.
Depois de dois a cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione oito mililitros de meio fresco à placa para parar a reação e resuspensar as células separadas com tubulação suave. Transfira a solução celular para um tubo estéril de 15 mililitros e colete as células por centrifugação. Resuspengue a pelota em 10 mililitros de PBS e centrifuge as células novamente.
Resuspend a pelota em 10 mililitros de média para contagem e diluir as células para uma de uma a duas vezes 10 a 5ª células por mililitro de concentração média de cultura celular. Em seguida, semente 500 microliters de células em cada poço de uma placa inferior de imagem estéril de 12 poços e colocar a placa na incubadora de cultura celular para permitir que as células aderam à superfície da placa. Não mais do que 30 minutos antes da imagem, adicione uma concentração relevante de uma droga mitótica a um ou mais dos poços e adicione um volume igual do inibidor diluído ao mesmo número de poços que os controles.
Para preparar o microscópio para imagem, coloque a placa no palco de um microscópio de epifluorescência invertido equipado com uma câmera de alta resolução, uma câmara ambiental pré-superaquecida a 37 graus Celsius e um sistema de entrega para dióxido de carbono umidificado de 5%. Selecione um objetivo de ar 20 vezes com uma abertura numérica de 0,5 e equipada para a fluorescência de alto contraste e contraste de fase, ou imagens de campo brilhante e visualize as células para ajustar o curso e encontrar foco para colocar as células em foco. Para definir os tempos de exposição ideais para aquisição de imagens de campo brilhante, GFP e RFP, selecione os respectivos cubos de filtro com a excitação e emissão adequadas para os fluoroforos que serão imagens e clique em Reproduzir.
Se o sinal não for suficientemente intenso, ajuste a exposição automática e em cada canal fluorforeiro selecione o binning apropriado do menu suspenso Formato. Selecione e calibra o estágio do microscópio para o prato multi-poço de acordo com as instruções do fabricante e use o software de aquisição de imagens para destacar ou selecionar os poços que serão imagens. Abra o painel de controle de pontos gerados e em Área de Trabalho selecione Restrito e Fronteiriço para restringir a área de seleção de coordenadas para excluir os limites do poço.
No menu suspenso de restrição de área, selecione Área Completa e selecione uma colocação aleatória de pontos. Defina a contagem para seis e clique em Randomize para selecionar o número e a distribuição dos pontos a serem capturados por poço, respectivamente. Em seguida, clique e digite os valores no painel de controle de sequência de tempo para selecionar e inserir o intervalo de tempo e a duração para coletar as imagens.
Para visualizar a cromatina rotulada RFP-H2B, selecione as imagens capturadas com o cubo do filtro RFP no lugar e identifique uma célula que entra em mitose, conforme indicado pela compactação inicial de cromatina e quebra de envelope nuclear para determinar o tempo mitotístico do alinhamento da metafase e do aparecimento de anafase em células individuais. Acompanhe a célula de interesse através de pontos de tempo consecutivos no filme adquirido para determinar o número de pontos de tempo ou minutos da entrada mitótica até que a cromatina rotulada RFP-H2B complete o alinhamento no equador da célula durante a metafase. Para monitorar o tempo mitotístico, a fidelidade mitótica e o destino celular, continuem a rastrear a célula através de pontos de tempo consecutivos para identificar a coordenada de tempo em que a segregação do cromossomo anafase é aparente e/ou quando ocorreu a descompação da cromatina e a reforma do envelope nuclear.
Em seguida, visualize rfp-H2B para identificar células em cada população que apresentam defeitos mitóticos, incluindo cromossomos atrasados e pontes de cromatina durante a segregação do cromossomo anáfase. Ao visualizar a tubulina alfa-EGFP, pode-se observar que as células que experimentam a interrupção do fuso sofrem mudanças dinâmicas à medida que o foco de tração do fuso é alcançado e um fuso mitotístico bipolar é formado em preparação para a divisão celular. Simultâneo com montagem de eixo, o movimento do cromossomo pode ser visualizado com RFP-H2B para avaliar o alinhamento cromossomo e a fidelidade da segregação.
Usando abordagens de imagem de células vivas, esses resultados representativos mostram que as células com conteúdo centralo normal são capazes de proceder desde a quebra do envelope nuclear até o alinhamento de metafase e o início da anfífase para alcançar uma divisão bipolar em menos de 30 minutos. Na presença de centrosomos extras, quase 50% das células são capazes de superar um fuso mitocótico multipolar transitório e formar um fuso bipolar na divisão celular completa. As células restantes são incapazes de alcançar um fuso bipolar e, como resultado, saem da mitose através de uma divisão multipolar.
Independentemente de se a bipolaridade do eixo for alcançada, as células com centrosomos extras apresentam uma duração significativamente maior de mitose em comparação com células com dois centrossomos. Indicando que a dinâmica da progressão mitótica pode ser alterada mesmo quando as alterações no desfecho mitótico não são aparentes. Ao definir os tempos de exposição para canais fluorescentes, otimize os tempos de exposição para limitar a fototoxicidade.
Além disso, o binning de pixels da câmera pode ser selecionado para permitir que menores tempos de exposição sejam usados. Este procedimento tem aplicações em triagens farmacológicas, invasão e análise migratória. Essas abordagens também podem ser empregadas para examinar a eficácia dos tratamentos medicamentosos ou a dinâmica da motilidade celular.
