Este estudo foi financiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR projecto-2010-BLAN-1535) e por uma bolsa da região de Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).

1. Produção e purificação de proteínas <ol><li> Mexa, MexB de Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Transforme os plasmídeos contendo os genes Mexa e MexB em um E. coli estirpe de produção (por exemplo, C43 DE3). Placa em LB Agar suplementado com o antibiótico apropriado. Escolha uma única colônia para inocular um pré-cultivo O / N. Na manhã seguinte, inocula a pré-cultura em 1 L de LB e crescer a 37 ° C, sob agitação (240 rpm). </li><li> Uma vez que as células tenham atingido a fase exponencial (DO600 = 0,6-0,8) induzir com IPTG a 1 mM. Realizar a indução por 2-3 horas a 30 ° C, sob agitação. </li><li> Células de centrifugação (9000 xg durante 20 minutos) e ressuspender em 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. </li><li> Disrupt células usando uma prensa francesa (10.000 psi, 4 pass). Descarte as células intactas e corpos de inclusão por centrifugação a 9000 xg por 20 min. </li><li> Membranas de pellets 1 hora a 100.000 x g e resuspend cada pellet em 30 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM. </li><li> Determinar a concentração de proteína total da membrana utilizando o ensaio colorimétrico de BCA e solubilizar as membranas de O / N com 2% de maltósido de dodecilo (DDM) em um volume final determinada de modo que o detergente: proteína é de 1:1,5 (w / w). </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 h para descartar o material não solubilizado e agregados. </li><li> Incubar o sobrenadante, durante 2 horas a 4 ° C com uma resina de níquel (mexa purificação) ou uma resina de cobalto (MexB purificação) equilibrada com bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Despeje a resina em uma coluna vazia. Recolher o fluir. </li><li> Lava-se a resina com 50 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM, em seguida, com 25 ml de bis-Tris 10 mM, pH 6, glicerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Eluir o protein com 20 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol a 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. </li><li> Concentra-se a proteína com um dispositivo de ultrafiltração até 3 ml e carga sobre uma coluna de dessalinização, equilibrada com um tampão livre de imidazol. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga proteínas solubilizadas (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Em seguida, concentra-se a proteína novamente até 0,3 ml. </li></ol></li><li> Bacteriorodopsina de Halobacter Salinarium <ol><li> Cultivar células Salinarium Halobacter sob iluminação a 37 ° C durante 10 dias num meio de crescimento líquido contendo NaCl 4 M, MgSO4 a 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, extracto de levedura 5 g / L, e peptona 5 g / L. </li><li> Disrupt células por diálise contra água deionizada. </li><li> Purifica-se a membrana de púrpura de 30-40% (w / v) gradiente de sacarose (100.000 xg durante 17 horas). </li><li> Solubiliza-se a suspensão de membrana com 2% octylglucOside durante 24 horas a 37 ° C (volume para a solubilização, a fim de voltar a suspender a membrana a um detergente 2:1 (w / w): proteína). Estimar a concentração de BR solubilizado usando ε (570 nm) = 54.000 M-1 cm-1. Pouco antes de reconstituição (ver abaixo), ultracentrífuga a BR solubilizado (100.000 xg por 20 min) para se livrar de lipídios e proteínas não solubilizado. Nota: As membranas nativas são naturalmente enriquecida em BR por isso não purificação adicional é necessária. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de proteolipossomas <ol><li> A formação de lipossomas: Coloque 400 ul de DOPC dissolvido em clorofórmio (25 mg / ml) em um copo de vidro e adicionar 1,5 mg de colesterol armazenado como um pó. Seca-se-lhes imediatamente antes da manipulação sob uma corrente de azoto ou de vácuo durante pelo menos uma hora numa proveta de vidro. O DOPC: proporção molar de colesterol é de 3,3:1. <ol><li> Depois de terem secado, hidratar os lípidos com 1 ml de HEPES 25 mM, pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, 2 mM de piranina. A suspensão deve aparecer turvação nesta fase. </li><li> Aquece-se a solução durante 10 min a 37 ° C. Sonicar durante 10 min a 40 W com 30 seg de pulso, 30 sec ciclos de pausa à TA. A suspensão deve aparecer clara nesta fase. </li><li> Para obter uma população de lipossomas monodispersas, realizar dois ciclos de extrusão e para cada ciclo, passar a suspensão de lipossomas através do filtro, pelo menos, 11x. Para o primeiro ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 200 nm e para o segundo ciclo, utilizar uma membrana de tamanho de poro de 100 nm. Medições de dispersão de luz dinâmica pode ser realizada nesta etapa para verificar a homogeneidade da suspensão. </li></ol></li><li> Incorporação de proteínas Princípio: proteínas de membrana pode ser reconstituída em lipossomas, graças ao efeito solubilizante de detergentes. Lipossomas detergente solubilizou-se a incubação com a proteína de membrana solubilizada em detergente e a formação do proteoliposomes é desencadeada por uma rápida eliminação do detergente com grânulos de poliestireno 9. <ol><li> Adicionar 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) e incubar O / N a 4 ° C (a temperatura de solubilização pode ser adaptado para a proteína a ser estudado). </li><li> Adicionar a proteína solubilizada em detergente (BR, MexB e mexa) para os lipossomas dissolvidos, e incubar 15 min a 4 ° C. Adicionar as proteínas para a suspensão de lipossomas solubilizado nas seguintes proporções (w / w): lípidos / MexB = 20, MexB / mexa = 2,5, e lípidos / BR = 30. </li><li> Adicionar pérolas de poliestireno em um 30:1 grânulos: proporção de detergente (w / w, considerando o peso total do detergente, inclusive detergente adicionado com as proteínas purificadas) e incubar 5 h, no escuro (por causa da BR) à TA sob suave agitação. Antes deste processo, activar as BioBeads com metanol e etanol e incubação extensivamente lava-se com água. </li><li> Purifica-se a proteína proteolipossomos e substratos livres utilizando um PD-10coluna de dessalinização, equilibrada com HEPES 25 mM, pH 7, K 2 SO 4 100 mM e MgCl 2 a 2 mM. </li><li> Armazenar os proteolipossomas a 18 ° C no escuro até 2-3 semanas. </li></ol></li><li> Avaliação da eficácia de reconstituição em gradiente de sacarose. Para verificar que tanto o MexB ea BR foram reconstituídos em lipossomos, purificar a suspensão proteolipossomos em um gradiente de sacarose descontínua. <ol><li> Suavemente resolver os proteolipossomas em um gradiente de cinco camadas de sacarose (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v). </li><li> Ultracentrifuge para 17 horas a 100.000 xg (com aceleração mínima e taxas de desaceleração). </li><li> Recolher cuidadosamente as várias fracções do gradiente (especialmente as interfaces entre cada camada de sacarose), e analisadas em SDS-PAGE (10%) por meio da coloração com Coomassie ou transferência de Western. Proteínas agregadas são encontrados no fundo do tubo, enquanto que, as proteínas de detergente solubilizado nonincorporated são encontrados na parte superior dao tubo. Proteolipossomos e lipossomas são encontrados nas interfaces de sacarose que correspondem à sua densidade intrínseca. Lipossomas vazios são recuperados mais acima no gradiente do que os proteolipossomos. </li></ol></li></ol> 3. A medição de fluorescência <ol><li> Efectuar as medições de fluorescência a 25,0 ° C por meio de um espectrofluorómetro permitindo medições de duplo comprimento de onda (luz de Xe, 150 W). Períodos de iluminação alternativa (para ativar a BR com comprimentos de onda de excitação / emissão de 550 nm / 550 nm) e medições de fluorescência com comprimentos de onda de excitação / emissão de 455 nm / 509 nm por 2 segundos para medir a fluorescência piranina. Defina as larguras de banda de excitação e emissão de 5 nm. Efectuar as medições na presença de 50 nM de valinomicina para prevenir a formação de um potencial de membrana ΔΨ inversa. Nota: Na verdade, porque as bombas de prótons BR, há mais cargas positivas no interior do lipossoma do que fora. Esta cargagradiente podem ser descartados utilizando valinomicina, que é um K + ionóforo selectiva. Uma vez adicionados à valinomicina lipossomas suspensão, tal como uma molécula hidrófoba, se inserir na membrana do lipossoma, transportar passivamente K +, e, portanto, a dissipar o potencial de membrana ΔΨ. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

Não há nada a divulgar.

Descreve-se um processo de reconstituição projetado para ensaio transporte de proteínas de membrana. Uma vez estabelecido, o processo de reconstituição da proteína leva à medições que são muito reprodutíveis. No entanto, as condições exactas para reconstituir a proteína irá variar a partir de uma proteína para outra. Muito cuidado deve ser tomado na otimização dos seguintes parâmetros: i) qualidade da purificação (pureza e ausência de material agregado); ii) a eficiência da etapa de detergente de solubilização (quando possível, de baixo detergente CMC devem ser preferidos porque são mais fáceis de obter livrar), iii) dessorção do detergente (que é por exemplo possível combinar o uso de esferas de poliestireno com um passo de diálise, mas este facto pode afectar a taxa de dessorção, um parâmetro crítico para a actividade posterior da proteína, ver ref [ 9]), iv) a reconstituição de lípidos (a natureza química do lípido, o lípido e o rácio de proteínas, a presença de amphiph adicionaliles são parâmetros críticos que devem ser variadas e otimizado). Na temperatura de adição e tempo de incubação afeta todas estas questões. O controlo de qualidade é portanto primordial em cada passo do procedimento de reconstituição. Deste ponto de vista, de dispersão de luz é uma técnica muito conveniente porque é rápida, não destrutiva, e requer apenas 20 ul de amostra a uma concentração na gama micromolar. Uma vez que os proteolipossomas são formados, gradiente de sucrose é também de grande ajuda porque abre o caminho para uma verificação sistemática de reconstituição: qualitativa (a proteína é, de facto incorporada na membrana do lipossoma), bem como quantitativo (quantos proteína em um lipossoma). Este último seria abordada por medir com precisão a proteína e concentrações de lipídios. Nosso ensaio não depende da titulação do próprio substrato e isso evita considerações inquietos a respeito de possível difusão passiva artifactual de<html> molécula devido a partição hidrofóbica nas membranas. O ensaio explora as propriedades de piranina como sonda confiável e quantitativa de mudanças de monitoramento de pH. Nossos resultados estão de acordo com os resultados obtidos com outro procedimento onde a formação de gradiente de prótons foi realizada utilizando valinomicina 10, mas permite um gradiente mais robusta e reproduzível 11. Além disso, o gradiente de protões pode ser ajustada precisamente, simplesmente pela variação da concentração do tampão (para mais detalhes ver 12 Verchere et al.). No processo de uma medição de controlo é efectuado em primeiro lugar, na ausência de substrato (o que dá acesso à actividade passiva da proteína). A actividade efectiva transportador de proteína de membrana é então medida após o substrato ter sido adicionado na mesma cuvette. Este é verdadeiramente um activo porque o experimento pode ser considerado como um verdadeiro, resultado induzido pelo substrato não ambíguo,. ent &quot;&gt; O protocolo pode ser adaptado para alto, médio rendimento (por exemplo, medições de 96-poços) automatização pois iluminar a amostra provoca a automatização e paralelização reacção. consistiria na preparação de um lote grande de proteolipossoma, e na distribuição de alíquotas em 96 poços de placa. substratos (e também possíveis inibidores) seria então adicionado e após a incubação no escuro durante 45 min, a placa de ser sujeito a ciclos de medição de fluorescência de iluminação / piranina num leitor de microplacas. Para obter informações adicionais sobre o protocolo, os leitores são convidados a ler Verchere et al. 12,13

Proteínas de membrana integrais representar até 30% dos genes codificados em genomas eucarióticos. Eles compartilham um papel central, como a manutenção de portão (receptores), transporte de nutrientes, íons ou compostos nocivos (transportadores) ou a manutenção da permeabilidade da membrana através de camadas duplas (canais) entre todas as células vivas 1. As bombas de efluxo tem um papel central na resistência contra a terapia antibiótica 2. Em bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa, que é protegida por uma membrana externa, transportadores de efluxo são organizadas como sistemas de tripartidos onde MexB, a bomba de efluxo localizadas na membrana interna, trabalha em conjunto com mexa, uma proteína periplasmática, e, uma OprM canal de membrana externa. A proteína de membrana interna citoplasmática funciona como uma bomba dependente de energia com uma ampla especificidade de substrato. A proteína da membrana externa actua como uma porina enquanto que o terceiro é localizado no espaço periplasmático e é pensado para estabilizar o complexo inteiro <sup&gt; 3. A seguir, vamos nos concentrar no projeto de um ensaio funcional para a montagem Mexa MexB. A informação estrutural acumulou ao longo dos últimos cinco anos, graças à determinação de raios-X do AcrB proteína homóloga de Escherichia coli 4-7. Embora seja claramente importante par dessa informação com dados dinâmicos e cinéticos, a concepção de um ensaio funcional para este transportador é um verdadeiro desafio 8. Com efeito, as proteínas da membrana deve ser mantida em um ambiente membranoso e um compartimento fechado deve ser mantida durante um transporte vectorial de substrato a ser alcançado. Reconstituição de proteínas de membrana em proteolipossomos foi amplamente apresentados e analisados ​​(ver Rigaud e Levy 9). Tais protocolos de permitir a monitorização da actividade de proteínas de membrana, por exemplo, seguindo os substratos através da membrana do lipossoma. Neste caso, surgem limitações do umDisponibilidade de substratos tituláveis ​​(fluorescente, radioactivo, etc.) e do facto de que, muitas vezes, estes substratos são hidrofóbicos e têm uma tendência para atravessar as membranas, independentemente da presença do transportador. Como alternativa, pode-se seguir as variações espectroscópicos de um corante relatando sensível a alterações químicas que ocorrem como consequência do transporte. Como afirmado acima, os prótons energizar o transporte via MexB. Assim, uma opção relevante é monitorar as variações espectroscópicas de um corante relato sensível ao pH para acompanhar variações de pH, devido ao transporte de substrato-driven próton. A escolha de um corante fluorescente evita quaisquer efeitos artefatuais devido à natureza hidrofóbica do substrato. Uma dificuldade adicional é a geração de um gradiente de protões. Vários protocolos podem ser encontrados na literatura. Entre eles, o uso da técnica de valinomicina é generalizado, mas mostrámos que é entediante para executar 10-11. Além disso, énão reprodutível e não é reversível. Nós têm recorrido ao uso de bacteriorodopsina (BR), uma bomba de protões activado pela luz de Halobacter Salinarium, um obrigatório archaeon halofílica Gram-negativo aeróbico marinha. Esta proteína é coreconstituted em lipossomas com MexB e, após a iluminação, BR bombas de protões no interior dos lipossomas e, portanto, cria o ΔpH (ácida para dentro) necessária para a proteína de transporte do substrato 12-13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

Há uma necessidade científica emergente para ferramentas confiáveis ​​para monitorar transporte de proteínas de membrana. Apresenta-se um método que conduz à reconstituição das bombas de efluxo na bactéria gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, em um ambiente biomimética que permite uma investigação precisas da sua actividade de transporte. Três pré-requisitos são cumpridos: compartimentação em um ambiente lipídico, o uso de um índice relevante para o transporte ea geração de um gradiente de prótons. O transportador de proteína de membrana é reconstituído em lipossomas, juntamente com bacteriorodopsina, uma bomba de protões activado pela luz que gera um gradiente de protões, que é robusta, assim como reversível e ajustável. A actividade da proteína é deduzida a partir das variações de pH que ocorrem no interior do lipossoma, usando pyranin, uma sonda fluorescente dependente de pH. Descreve-se um procedimento passo-a-passo em que a purificação da proteína da membrana, a formação de lipossomas, a reconstituição da proteína, e um transportenálise são abordados. Apesar de terem sido concebidos especificamente para um transportador de RND, os métodos descritos poderiam ser adaptados para utilização com qualquer outro transportador de proteína de membrana energizados por um gradiente de protões.

O ensaio consiste de monitorização de piranina fluorescência como uma função do tempo, enquanto um gradiente de protões é gerado. Para esse fim, as amostras são submetidas a iluminação alternativamente (daí bombear protões pela BR é desencadeada) e, em seguida, para medições de fluorescência utilizando excitação e emissão de comprimentos de onda de piranina (λ ex = 455 nm e λ em = 509 nm). A Figura 1 mostra um controlo representativo obtidos com o ensaio, na ausência de mexa / MexB, verificando que o gradiente de protão gerado pela BR é reversível. Depois de um ciclo de acidificação, proteolipossomas são mantidos no escuro durante 45 minutos a fim de parar a BR para bombear protões (protões difundir lentamente e de forma passiva através de bicamadas lipídicas após o seu gradiente de concentração). Após este tempo de recuperação, a activação de BR é possível, simplesmente, iluminando a mesma suspensão novamente. Figura 2corresponde a uma medição de transporte real. Um controle negativo com lipossomas livres de proteínas mostra que, como esperado, o pH é constante sobre iluminação (Figuras 2A e 2B, os círculos de laranja). No entanto, proteolipossomas contendo BR nas suas membranas não bomba de protões, assim, o pH dentro dos lipossomas diminui e um gradiente estável é construído (Figuras 2A e 2B, quadrados roxo). Triângulos cinza e diamantes vermelhos (Figura 2A) representam pH dentro de proteolipossomos contendo BR e MexB, na presença ou na ausência de Hoechst 33342, respectivamente. Observamos uma atividade independente do substrato onde o gradiente de prótons é apenas parcialmente dissipada por MexB contra-transporte. Atribuímos essa observação a uma atividade basal de MexB. A fim de testar o efeito de mexa na actividade de MexB, mexa foi adicionado para a reconstituição, o primeiro na ausência de qualquer tipo de substrato ( <strong&gt; Figura 2B, diamantes azuis). Mais uma vez, o gradiente de protão gerado pela BR é apenas parcialmente dissipada. A medição de transporte real é realizado no mesmo exemplo. Previamente, o gradiente de protões deve ser reinicializado e o substrato tem de ser adicionado à suspensão a fim de atingir o seu sítio de ligação na proteína. Para esse efeito, a suspensão foi incubada no escuro, na presença do substrato durante 45 minutos. Após a iluminação posterior, pode-se ver que o gradiente de prótons gerado pela BR está agora totalmente dissipada por MexAB (Figura 2B, triângulos verdes), como conseqüência do transporte de substrato pela bomba. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Figura 1 Reversibilidade da gradiente de prótons construído pela iluminação BR: piranina fluorescência de proteolipossomos BR medidos em função do tempo. De 0-15 min, BR bombas de prótons como resultado da ativação de luz. De 15-60 min, proteolipossomas são incubados no escuro, durante este tempo, protões passivamente mova para fora dos lipossomas, até o pH intravesicular e pH extravesicular são iguais. De 60-75 min, BR ainda é funcional e bombas de prótons sobre iluminação. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figura 2 Transporte ensaio: piranina fluorescência, convertidos para os correspondentes variações de pH, em função do tempo A) pH dentro dos lipossomas de controlo (círculos laranja); pH dentro de proteolipossomas contendo BR na membrana (quadrados roxo), pH dentro. de proteolipossomas contendo BR, e MexB na membrana sem Hoechst 33342 (d vermelhoiamonds); pH dentro de proteolipossomos contendo BR e MexB na membrana com Hoechst 33342 (triângulos cinza) B) pH dentro de lipossomas de controle (círculos laranja);. pH dentro de proteolipossomos contendo BR na membrana (quadrados roxos); pH dentro de proteolipossomas contendo BR, MexB e mexa na membrana sem Hoechst 33342 (diamantes azuis); pH dentro de proteolipossomas contendo BR, MexB e mexa na membrana com Hoechst 33342 (triângulos verdes).

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Nós apresentamos um protocolo para a investigação in vitro de bombas de efluxo de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite a geração de um gradiente de protões robusto, reversível, e ajustável dentro da membrana do lipossoma e, portanto, deve ser adaptável a qualquer proteína da membrana energizado pela força protomotive.

In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K visualizações.  CNRS & Université Paris Descartes.  Nós apresentamos um protocolo para a investigação in vitro de bombas de efluxo de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite a geração de um gradiente de protões robusto, reversível, e ajustável dentro da membrana do lipossoma e, portanto, deve ser adaptável a qualquer proteína da membrana energizado pela força protomotive. 

Vídeo: In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biologia

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

MALDI por espectrometria de massa de imagens de Investigação de metabólitos em<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Os nódulos radiculares

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Sincronização de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para Investigação do Ciclo Celular Bacteriana

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Análise Unicelular da Expressão de Genes de Seringas de Pseudomonas syringae no Tecido Vegetal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Investigando o mecanismo de transporte de zinco em células de mamíferos com o ensaio FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autor em destaque: Explorando a regulação celular do zinco por meio da funcionalidade ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caracterização de Transportadores de Zinco em Mamíferos Utilizando um Ensaio de Transporte de Zinco In Vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...