קיפוח ראייה חד-תאי הוא פרוטוקול ניסיוני מצוין כדי לגרום לפלסטיות ראשונית של תגובה קליפת המוח החזותית. בדרך כלל, נוירונים במקטע המשקפת של קליפת הראייה העיקרית בעכבר מגיבים כפליים חזק לגירוי של העין ההפוכה כמו לעין ipsilateral. עם זאת, תפר לעצום את העין ההפוכה במהלך התקופה הקריטית עבור פלסטיות דומיננטיות עינית לגרום לאובדן מהיר של היענות על ידי נוירונים V1 לגירוי העין ההפוכה וגם ואחריו עלייה לאחר מכן בתגובה לעין ipsilateral.
כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול הניסיוני עבור קיפוח חד מולקולרי ולהציע שיטה נפוצה לנתח את המגמה של דומיננטיות העין במהלך קיפוח חזותי. שים את הכלים הכירורגיים בקופסת אלומיניום ו autoclave אותם תחת 120 מעלות צל"ש במשך חצי שעה. הכינו תות 2% בקומקום אמבט מים והמשיכו לשמור עליו ב-75 מעלות צל כיפת ים.
יש למרוח שכבה דקה של משחת עיניים על שתי העיניים. מתחת למיקרוסקופ האנטומי עם תאורה, לתפור את העפעפיים. לעשות בערך ארבעה תפרים.
הפוך שניים עד שלושה צמתים של הליך המשנה. החל שלושה microliters של דבק ייבוש מיידי 502 על ראש הצומת כדי להגביר את היציבות של הצומת. ואז לחתוך את החוט קצר מספיק.
כאשר העכבר ער לחלוטין, מניחים אותם בכלוב מעצר מופרד. לפני הקלטה אלקטרופיזיולוגית, השתמש isoflurane כדי להרדום את העכבר. הסר את התפרים ולחשוף את גלגל העין.
בזהירות לקצץ את העפעף. לשטוף את העיניים עם פתרונות עדשות מגע ולבדוק את העיניים לבהירות. ניתן להשתמש רק בעכבר עם מצב טוב של גלגלי העיניים.
לאחר הרדמה של העכבר, מקם את העכבר על מסגרת סטריאוטוקסית. השתמש כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאורך כל ההליך. החל את משחת העין על פני השטח של העיניים כדי לשמור אותו לח.
הסר את השיער של העכבר כדי לחשוף את העור שלה. חתוך שמונה מילימטרים כפול שמונה מילימטרים של שטח העור בין שתי האוזניים כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר את רקמת הקרקפת. ואז להסיר את רקמת החיבור overlying עם מי חמצן.
לקדוח חור בגולגולת מעל המוח הקטן. תקן בורג עצם קטן בחור כהפניה. בצע גולגולת קטנה בקוטר של מילימטר אחד באזור משקפת V1.
הסר בזהירות את שבר הגולגולת מבלי לפגוע במוח. מכסים את המשטח קליפת המוח חשוף עם 2% agarose כדי למנוע ייבוש. תקן אלקטרודה טונגסטן על המסגרת הסטריאוטוקסית.
מניחים את האלקטרודה טונגסטן אנכית על אזור V1 משקפת כדי לוודא כי התאים המתועדים מגיב לשתי העיניים. הגירוי מופרד על ידי 30 מעלות בבלוק אקראי. בכל מדידה הוצגו בסך הכל שלושה עד חמישה בלוקים.
מסווה עין אחת עם צלחת פלסטיק לא שקופה. הצג LCD1 למיקום ב 23 ס"מ מעיניים של העכבר. התקדמות מיקרואלקטרוניקה לאט על ידי מיקרומניפולטור שמן הידראולי.
עצרו את התקדמות אותות יחס רעש האות הגבוה כאשר האלקטרודה מתקדמת לשכבה 4 ולהתחיל במדידה. אנחנו מגבירים את פעילות ספייק בגורם של 1, 000 ולסנן אותו מ 300 עד 10 קילוהרץ ולאחר מכן לדגום אותו ב 40 קילוהרץ. ואז להסוות את העין השנייה ולמדוד את התגובה של העין ההתמדה.
אותות הנמדדים על ידי אלקטרודות בודדות הם פעילויות אוכלוסייה. השתמש בתוכנה כדי להפריד קוצים של תאים שונים. ראשית, לסנן את האות מ 500 ל 5, 000 הרץ.
הגדר שני סמנים, אחד להטיה חיובית ואחד עבור קוצים הטיה שלילית. כוונן תבניות ספייק. הגדר את אזור התבניות שבו הוא מציג את הווריאציה הגדולה ביותר בין מחלקות שונות של קוצים.
השתמש בניתוח רכיבים ראשיים כדי להפריד אותם לאשכולות. סווג את הקוצים של גבול באמצעות אלגוריתם K פירושו. לתאם את האוריינטציה עם קצב ירי ספייק ולתכנן את עקומות כוונון הכיוון עבור העיניים ipsilateral ו contralateral.
לאחר מכן לחשב את אינדקס OD עבור תאים בודדים המייצג את התגובה הנוגדנית ו ipsilateral להקצות ציון OD עבור כל תא על פי אינדקס OD. חשב את אינדקס ההטיה ההיפר-צדדית בהתאם לנוסחה. דיאגרמה זו מציגה את עקומות כוונון האוריינטציה של העין ההפוכלית והנוגדנית בעכבר חד-תאי מקופח ובלתי מפוקח.
פרוטוקול זה מאפשר קיפוח חזותי חד-תאי מוצלח ומדידת דומיננטיות עינית מעכבר מקופח ועכבר לא מפוצל בתקופה קריטית. אנחנו רק הראינו לך איך להשיג את הניסוי הזה וניתחנו את השינוי בדומיננטיות העין במהלך קיפוח חזותי. במהלך הניסוי, חשוב להימנע מזיהום בתהליך התפירה ובאינטראקציה תוך הקלטה אלקטרופיזיולוגית.
תודה שצפית בוידאו שלנו.
