Este protocolo facilita análises quantitativas de pequeno a grande porte do conteúdo lipídado de armazenamento celular em uma variedade de espécies de leveduras e o faz de forma imparcial e padronizada. A técnica permite o processamento rápido de imagens microscópicas e fornece saídas quantitativas detalhadas para comparar facilmente amostras como vários mutantes e células cultivadas em diversas condições. Para começar, acompanhe o protocolo de texto que acompanha as soluções de coloração, mídia cultural e células.
Certifique-se de que as células estão saudáveis e na fase de crescimento desejada antes de executar o experimento. Em seguida, prepare uma mancha de microscópio para que cada amostra seja imageda. Espalhe um microliter de solução de revestimento deslizante em uma tampa limpa usando o lado longo de uma ponta de pipeta posicionada horizontalmente.
Deixe a solução de revestimento secar completamente e, em seguida, armazene as tampas em um ambiente sem poeira. Em seguida, medir as densidades ópticas das culturas celulares, e para que as culturas sejam analisadas na mesma fase de crescimento, tente alcançar valores semelhantes entre todas as culturas testadas para garantir condições experimentais comparáveis. Então, pipeta um mililitro da cultura celular em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Somente para as células S.cerevisiae, adicione cinco microliters da solução de revestimento de slides ao tubo também. Em seguida, brevemente vórtice todos os tubos de microcentrifuuge, e incuba-los a 30 graus Celsius com agitação por cinco minutos. Em seguida, adicione um microliter da solução de coloração lipídica a cada alíquota de cultura, e vórtice-los brevemente.
Em seguida, adicione 10 microliters da solução de visualização do limite celular, e o vórtice-os brevemente uma segunda vez. Colete as células centrifugando-as a 1.000 vezes a gravidade por três minutos à temperatura ambiente. Quando terminar de girar, remova 950 microliters do supernascer e resuspense as células no restante do supernatante usando uma pipeta.
Em seguida, pipeta dois microliters da densa suspensão celular em um deslizamento revestido de lectina. Em seguida, coloque a mancha de cobertura em um slide de microscópio limpo para formar uma monocamada celular, e prossiga para microscopia o mais rápido possível para minimizar artefatos em imagens. A configuração do microscópio requer longas exposições a fontes de luz fortes que podem causar danos à amostra e distorcer resultados.
Portanto, configure as condições de imagem usando um slide de amostra dedicado que não será mais utilizado para quantificação de gotículas lipídicas. Coloque a amostra dedicada no estágio de uma configuração de microscópio de contraste de contraste de fase ou interferência diferencial e foque nas células. No software do microscópio, defina as configurações de pilha Z para que elas abrangem todo o volume celular.
A distância vertical total depende do tamanho da célula, e o número de fatias ópticas depende da abertura numérica do objetivo. Em seguida, defina o foco para mover-se em relação ao plano focal central. Para imagens de gotículas lipídicas, ajuste experimentalmente a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal verde.
Tenha cuidado ao fotografar, pois o BODIPY é um fluorocromo muito brilhante que pode ser rapidamente fotobleachado. Além disso, minimize o tempo de exposição para evitar a supersaturação. Capture o canal verde z-stack primeiro antes de mudar para o canal azul para evitar desfocar as gotículas lipídicas móveis.
Para os limites das células de imagem, defina experimentalmente a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal azul. Se possível, configure e use um fluxo de trabalho experimental automatizado no software de controle de microscópio para facilitar a imagem de várias amostras em condições padronizadas. É importante ressaltar que todas as imagens devem ser adquiridas usando as mesmas configurações para permitir a comparação adequada entre as amostras.
Uma vez otimizadas as condições de imagem, concentre-se nas células e as imagem nos canais verde e azul. Imagem múltiplos campos de exibição por amostra para obter dados robustos e representativos. Salve as imagens Z-stack do canal azul e verde como arquivos TIFF multicamadas de 16 bits.
Certifique-se de incluir as palavras verde ou azul nos nomes de arquivo correspondentes. Abra imagens microscópicas no ImageJ e remova quaisquer pilhas de imagens contendo um número considerável de células que se moveram durante a aquisição. Estes aparecem em posições diferentes em seções individuais Z.
Em seguida, remova todas as pilhas de imagens que contenham partículas não-celulares altamente fluorescentes no canal azul. Isso é frequentemente causado por sujeira na superfície de imagem ou impurezas no meio de cultivo e pode interferir na detecção de células em suas proximidades. Além disso, remova quaisquer pilhas de imagens que contenham uma grande proporção de células mortas.
Essas imagens exibirão células com fluorescência azul aumentada em comparação com as células vivas. Embora a presença de algumas células mortas na amostra não seja tipicamente um problema e essas células sejam automaticamente descartadas durante a análise, algumas células mortas ou moribundas podem ocasionalmente ser reconhecidas como células vivas pelo algoritmo de segmentação e, portanto, distorcer os resultados relatados. Para começar a análise no MATLAB, primeiro crie uma pasta principal e copie todos os scripts MATLAB para este local.
Em seguida, crie subpastas com os nomes das várias espécies de leveduras e copie as respectivas imagens TIFF para esses locais. Agora, inicie o MATLAB, abra o script PRINCIPAL. m, e executar o script.
No menu, selecione as espécies de leveduras a serem analisadas e inicie o processamento da imagem. Inspecione e processe os arquivos de saída conforme necessário usando um editor de planilhas ou um pacote estatístico. O fluxo de trabalho produz arquivos CSV separados por ponto e vírgula e arquivos TIFF segmentados com objetos celulares detectados e gotículas lipídicas.
São mostradas aqui células S.pombe do tipo selvagem que foram cultivadas no complexo meio YES ou no meio EMM definido. Em comparação com as células cultivadas no meio YES, foram detectadas menos gotículas lipídicas e maior intensidade de coloração por unidade de volume celular no meio EMM. Além disso, as gotículas lipídicas individuais formadas no meio EMM foram maiores e apresentaram maior intensidade total de coloração.
Isso está de acordo com os achados anteriores do aumento do conteúdo lipídudo armazenado em células cultivadas em EMM. Em seguida, essas imagens mostram células S.japonicus de culturas exponenciais e estacionárias primitivas cultivadas em meio SIM. As células que entraram em fase estacionária mostraram um número significativamente reduzido de gotículas lipídicas por unidade de volume celular, enquanto a intensidade de fluorescência de gotículas lipídicas normalizada em volume diminuiu ligeiramente entre as duas condições.
As gotículas lipídicas de fase estacionária inicial eram tipicamente moderadamente maiores em tamanho e tinham intensidade de fluorescência total moderadamente maior em comparação com gotículas de células em crescimento exponencial. Em S.cerevisiae as células cresceram para fase exponencial versus estacionária, as células estacionárias continham um pouco menos gotículas lipídicas por unidade de volume em comparação com células em crescimento exponencial. No entanto, sua intensidade de fluorescência de gotícula normalizada em volume quase dobrou.
Este aumento acentuado no teor geral de gotículas lipídicas deveu-se à intensidade de fluorescência muito maior e ao volume de gotículas lipídicas individuais em fase estacionária. Após este procedimento, os dados de saída podem ser agregados em um pacote estatístico como R para criar parcelas de resultados resumidos e executar testes estatísticos sobre quaisquer diferenças observadas no conteúdo de gotículas lipídicas. Em princípio, o pipeline de processamento de imagens pode ser usado para análise de conteúdo de gotículas lipídicas em outros microrganismos ou para analisar outras estruturas subcelulares semelhantes a ponto.
