O rastreamento de molécula única 3D pode determinar as localizações subcelulares e comportamentos de movimento de proteínas individuais. Observar o movimento de uma proteína em uma célula viva fornece insights importantes sobre sua interação com parceiros vinculantes em seu ambiente nativo. O método aqui apresentado fornece uma estrutura geral para analisar dados de rastreamento de moléculas únicas para resolver os estados difusivos de moléculas biológicas.
Pode ser aplicado a trajetórias 2D e 3D que se limitam a volumes celulares arbitrariamente moldados. Depois de depositar contas fluorescentes em uma almofada de agarose pré-preparada, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, coloque-a em um deslizamento de tampa de microscópio e fixe o deslizamento de cobertura no suporte da amostra do microscópio. O suporte da amostra é então montado em um microscópio de fluorescência invertida.
Em seguida, inicialize a interface gráfica do usuário do microscópio;aqui, o software personalizado no MATLAB é usado para controle de instrumentos. Inicialize o software de câmera HCImage Live. Na guia Capturar sob a seção Controle de câmera, defina o tempo de exposição para 0,03 segundos e clique em Live para iniciar uma transmissão ao vivo da câmera.
Clique no botão Open Laser apropriado na interface GUI para desbloquear o laser e excitar as contas fluorescentes na almofada agarose. Visualize a emissão de fluorescência na câmera usando o modo de transmissão ao vivo. Ajuste as posições X e Y do estágio do microscópio clicando nas setas XY-Position sob a seção Micro-Posicionamento Stage da interface do usuário para posicionar pelo menos uma conta fluorescente no centro do campo de visão.
Se necessário, altere o tamanho da etapa clicando na caixa suspensa abaixo das setas. Em seguida, ajuste a posição Z do estágio do microscópio clicando nas setas de posição Z sob a seção Nano-Positioning Stage. Defina a orientação da função de propagação de ponto de dupla hélice da conta fluorescente para ser vertical.
Esta orientação vertical é definida como o ponto de partida na calibração Z. Escaneie 30 passos acima e abaixo da posição Z inicial em incrementos de 50 nanômetros. Grave 10 quadros em cada etapa usando um tempo de exposição de 0,03 segundos.
Para iniciar a aquisição automatizada de dados, clique em Ir sob Z-Calibração. Centrífuga um mililitro de cultura yersinia enterocolitica chocada pelo calor a 5.000 vezes gravidade por três minutos à temperatura ambiente, em seguida, remover a cultura e descartar o supernante. Lave a pelota três vezes com um mililitro de mídia M2G.
Após a lavagem final, resuspenque as bactérias pelotas em 250 microliters de mídia M2G. Em seguida, adicione contas fluorescentes para usar como marcadores fiduciários. A solução de contas fluorescentes deve ser adicionada de modo que haja apenas uma a duas contas por campo de visão quando visualizada no microscópio.
Misture suavemente a suspensão por vórtice para separar quaisquer células agregadas e a placa 1.5 de microlitros da suspensão em uma almofada de 1,5 a 2% de agarose feita com M2G, em seguida, inverter a almofada e colocá-la em um deslizamento de tampa de microscópio limpo de ozônio. Adicione uma gota de óleo de imersão no objetivo do microscópio e coloque o suporte da amostra no estágio do microscópio e fixe-o no lugar. Inicialize a interface gráfica do usuário para controlar a câmera do microscópio, o estágio de amostra e os lasers de excitação e, em seguida, inicialize o software da câmera.
Na guia Capturar sob a seção Controle de câmera, defina o tempo de exposição para 0,025 segundos e clique em Live para iniciar uma transmissão ao vivo da câmera. Ajuste as posições X e Y do estágio do microscópio clicando nas setas XY-Position sob a seção Estágio de Micro-Posicionamento para escanear ao redor da amostra e encontrar um campo de visão com uma população apropriadamente densa de células bacterianas. Para maximizar o throughput de dados, a densidade celular no deslizamento de cobertura deve ser o mais alta possível sem que as células se sobreponham ou se toquem.
O campo de visão também deve incluir pelo menos uma conta fluorescente como marcador fiducial para que a mudança de palco possa ser medida enquanto os dados são adquiridos. Em seguida, ajuste a posição Z do estágio do microscópio clicando nas setas de posição Z sob a seção Nano-Positioning Stage para que os lóbulos fluorescentes de dupla hélice de função de ponto de hélice sejam verticais. Em seguida, vá para Sequência e selecione Configurações de varredura.
Mude o número de quadros para 20.000. Em seguida, escolha uma pasta de destino de salvamento clicando no botão rotulado com três pontos. Por fim, clique em Iniciar para coletar até 20.000 quadros de câmera usando um curto tempo de exposição de 0,025 segundos.
Quando terminar, bloqueie a iluminação a laser clicando no botão Close Laser apropriado na interface gráfica do usuário. Em seguida, colete 200 quadros de imagens escuras usando o mesmo tempo de exposição. Verifique a caixa ao lado do LED thorlabs e clique em Alternar Espelho Para Cima.Isso acenderá a luz LED acima da amostra e alternará o microscópio da via de fluorescência para a via de contraste de fase.
Inicialize o software de aquisição de dados na via de contraste de fase e pressione o botão Iniciar/Stop Live Display para visualizar uma transmissão ao vivo da câmera. Em seguida, clique em Capturar e Ir para salvar a imagem para coletar uma imagem de contraste de fase das células no campo de exibição atual. Encaixe a conta fluorescente para uso como marcador fiduciário.
Encontre e encaixe todas as localizações e todos os quadros da câmera usando os limites de modelo descritos no protocolo de texto. De acordo com a seção Localize DHPSF SM da Gui Fácil-DHPSF, clique em Executar para encaixar sinais de molécula única e clique em OK nas seguintes janelas pop-up para manter as configurações padrão. O software encontrará sinais de fluorescência de molécula única que se assemelham à função de propagação de ponto de dupla hélice e, em seguida, tentará encaixá-los usando um modelo de dupla gaussiana.
À medida que o script é executado, o usuário verá uma exibição dos dados de imagem bruta, bem como uma imagem reconstruída dos sinais de molécula única com sucesso. Usando software personalizado no MATLAB, comece selecionando manualmente cinco pares de pontos de controle na janela pop-up, estimando e clicando nos polos celulares das mesmas cinco células, tanto nos dados de localização de uma molécula única quanto nos contornos celulares. Exclua células que contenham menos de 10 localizações e remova células que estão posicionadas parcialmente fora do campo de visão e, em seguida, exclua quaisquer células indesejadas adicionais na janela pop-up clicando dentro do contorno de sua célula.
Finalmente, atribua localizações que residem dentro do limite do contorno de uma célula para aquela célula. Descarte quaisquer localizações não localizadas dentro de qualquer contorno celular. Um fator crítico para a aplicação bem sucedida deste protocolo é garantir que os sinais de molécula única estejam bem separados um do outro.
Se houver mais de uma molécula fluorescente em uma célula ao mesmo tempo, então a localização pode ser incorretamente atribuída à trajetória de outra molécula. Este protocolo funciona para eliminar o problema de ligação, descartando quaisquer trajetórias para as quais duas ou mais localizações estão simultaneamente presentes na mesma célula. Assim, se os sinais de molécula única são muito densos, uma grande quantidade desses dados são automaticamente descartados durante o processamento.
Dependendo dos níveis de expressão das proteínas de fusão fluorescentes, aproximadamente 200 a 3.000 localizações podem ser geradas por célula. Essas localizações podem render entre 10 e 150 trajetórias. Um grande número de trajetórias são necessárias para produzir distribuições bem amostradas.
Mostrado aqui é o histograma de coeficientes de difusão aparentes para cerca de 80.000 trajetórias de molécula única da proteína de yersinia enterocolitica Tipo 3 YscQ rotulada com proteína fluorescente eYFP. O YscQ se liga aos injetores incorporados à membrana, resultando em uma fração de moléculas, cerca de 24% que não se difundem, como indicado pela distribuição mostrada em preto. As outras moléculas de YscQ se difundem livremente no citosol.
Durante o método descrito aqui, é determinado que moléculas de YscQ não ligadas existem em pelo menos três estados difusivos distintos. Essa conclusão foi alcançada mediante a adequação da distribuição de coeficientes de difusão aparentes com uma biblioteca de distribuições simuladas com coeficientes de difusão conhecidos. Ao tentar resolver vários estados difusivos, vários milhares de trajetórias de molécula única devem ser coletadas para garantir que as distribuições aparentes de coeficiente de difusão sejam muito bem amostradas.
O rastreamento de molécula única pode ser realizado em células do tipo selvagem ou em mutantes de exclusão genética para determinar se estados difusivos específicos se manifestam apenas quando um parceiro de ligação molecular está presente. Ao resolver os estados difusivos de proteínas citosóicas e complexos proteicos usando rastreamento de molécula única 3D, os pesquisadores podem determinar onde, quando e como os complexos proteicos oligomerílicos se formam em células vivas. Trabalhar com fontes laser de alta potência e patógenos humanos vivos pode ser extremamente perigoso.
Protocolos apropriados de segurança a laser e biossegurança devem ser sempre seguidos.
