Questa ricerca è stata finanziata in parte da un'Università del Connecticut Research Advisory Council Faculty Large Grant a M. Rubega. K. Burgio è stato sostenuto dalla National Science Foundation NRT- IGE grant #1545458 a M. Rubega. Il manoscritto è stato significativamente migliorato dal feedback ponderato di due revisori anonimi.

Questo lavoro non ha comportato alcun lavoro con animali vivi ed è stato quindi esentato dalla revisione della cura degli animali.
1. Allestimento e materiali (Figura 1)
<ol><li>Se le pelli piatte della specie di interesse non sono disponibili, utilizzare il protocollo29 di Spaw per creare pelli da esemplari freschi o congelati. Preen piume in una posizione ordinata, naturale e asciutta per ottenere un peso costante prima di procedere con le misurazioni.</li>
	<li>Impostare un bagno di acqua calda a temperatura costante. NOTA: Questo set-up è piuttosto alto, quindi è più facile posizionare il bagno di acqua calda sul pavimento.</li>
	<li>Posizionare un foglio di vetro acrilico trasparente(Tabella dei materiali)sulla superficie del bagno di acqua calda a temperatura costante. Il vetro consente la trasmissione del calore alla parte inferiore della pelle senza bagnare il campione. NOTA: Questo studio pilota ha utilizzato una lastra di vetro acrilico (0,125 di spessore). Lo spessore del vetro non influenzerà l'emissività30 del materiale (sarà sempre 0,86), ma influenzerà la temperatura assoluta sulla superficie del vetro (cioè, il vetro più spesso si tradurrà in una temperatura più bassa). Pertanto, tutte le misurazioni devono essere prese utilizzando una lastra di vetro acrilico dello stesso spessore.</li>
	<li>Posizionare un pezzo di cartone di schiuma (1 di spessore) con un foro circolare (0,5 di diametro) sul vetro acrilico. NOTA: La dimensione dell'uccello dovrebbe guidare la dimensione del foro e quindi la dimensione della piuma ininterrotta che riceve calore dalla fonte. Qui, viene utilizzato un foro di 0,5 di diametro, perché questa dimensione è abbastanza grande da ottenere una sufficiente trasmissione del calore al campione pur essendo abbastanza piccola da centrare il calore sotto i tratti di piume del seno (di tutti gli uccelli ad eccezione di quelli più piccoli). Indipendentemente dalle dimensioni dell'apertura termica, per ottenere un valore comparabile e replicabile per ogni uccello, assicurarsi di eseguire misurazioni con fori della stessa dimensione.</li>
	<li>Collegare una termocamera a un treppiede direttamente sopra la configurazione alla distanza minima di messa a fuoco della telecamera. NOTA: qui viene utilizzata una termocamera FLIR SC655 (risoluzione 680 px x 480 px, ±2 °C o ±2% di precisione di lettura, distanza minima di messa a fuoco di 40 cm). Altre fotocamere possono differire in grado di risoluzione.</li>
	<li>Calibrare la telecamera inserendo quanto segue nel software della termocamera:<ol>
<li>Trova la temperatura riflessa posizionando un foglio di alluminio (lato lucido rivolto verso l'alto) sopra la schiuma con il valore di emissività impostato su 1,0 nel software di calibrazione della fotocamera. Scatta un'immagine termica. La temperatura sulla superficie del foglio di alluminio è la temperatura riflessa, che dovrebbe essere simile alla temperatura ambiente della stanza.</li>
		<li>Impostare il valore di emissività31 su 0,95. NOTA: 1) L'emissività è la quantità relativa di calore che un oggetto emette32 e varia da 0 a 1. Un oggetto con un alto valore di emissività emette una grande quantità di calore, mentre un oggetto con un basso valore di emissività irradia poco calore32. Questo valore rappresenta l'emissività delle piume. 2) Questo valore (0,95) è contestato. Cossins e Bowler hanno affermato che le piume hanno un valore di emissività compreso tra 0,90-0,95, ma non hanno incluso alcuna prova31. Hammel ha riportato un valore di 0,98, ma ha ottenuto questo valore da un campione congelato, quindi potrebbe non essere accurato33. Nonostante la mancanza di prove, l'emissività di 0,95 è il valore più spesso utilizzato nella letteratura delle termocamere (come evidenziato da Cossins e Bowler31).</li>
		<li>Assicurarsi che la temperatura ambiente e l'umidità nella stanza siano costanti. Questi valori devono essere misurati prima di ogni misurazione e aggiornati nel software di calibrazione della telecamera. La temperatura e l'umidità di tutte le stanze interne fluttueranno leggermente, quindi registrare questi valori e aggiornarli nel software riduce l'errore di misurazione. NOTA: qui viene utilizzato il software FLIR ResearchIR Max. Questo software non salva i dati per tutte le immagini, quindi è fondamentale registrare tutti questi valori per ogni immagine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Esecuzione delle misurazioni
<ol><li>Impostare il bagno di acqua calda a temperatura costante su una temperatura target (40 °C è un proxy per la temperatura interna media interna della maggior parte degli uccelli passeriformi)34. NOTA: Se si lavora con una specie la cui temperatura interna a riposo è più alta (ad esempio, colibrì34) o inferiore (ad esempio, pinguini34 oratiti 34,35), può essere opportuno regolare il bagno di acqua calda di conseguenza. La Figura 3 mostra la relazione tra la temperatura del bagno di acqua calda e la temperatura sulla superficie del vetro acrilico (ad esempio, la temperatura effettiva della fonte di calore a cui è esposta la pelle piatta).<ol>
<li>I risultati ottenuti da questo protocollo (vedi Figura 5) suggeriscono che ottenere misurazioni su un intervallo di temperature è anche informativo sulle differenze di prestazioni termiche. Per fare ciò, seguire il protocollo utilizzando incrementi di 5 °C da 30-55 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Nel software della termocamera, disegnare un cerchio/ellisse sopra il foro nella schiuma in cui fuoriesce il calore. Ciò consente di visualizzare quest'area quando si posiziona la pelle sulla schiuma per garantire che venga misurata l'area corretta sulla pelle piatta.</li>
	<li>Posizionare il campione di pelle piatta sulla schiuma con l'area di interesse sopra il foro. NOTA: Qui, viene misurata la regione del ventre di ciascun uccello, perché non è ostruita da altre parti del corpo come l'ala ed è posizionata abbastanza centralmente da non essere soggetta a effetti di bordo. Il posizionamento della pelle sopra il foro di calore varierà a seconda della domanda sperimentale. In generale, si consiglia il posizionamento direttamente su un tratto di piume e il più lontano possibile dal bordo della pelle. Assicurati di non appiattire o disordinare le piume quando si posiziona la pelle. Se necessario, preen loro in una posizione naturale una volta che la pelle è posizionata.</li>
	<li>Attendere 15 minuti per consentire alla pelle di acclimatarsi alla fonte di calore. Se le misurazioni vengono effettuate troppo presto, il valore della temperatura sulla superficie del mantello di piume sarà troppo basso. Qui, la trasmissione della temperatura attraverso la pelle e le piume si è stabilizzata a 15 minuti, quindi aspettare più di 15 minuti non produrrà un risultato artificialmente alto.</li>
	<li>Scattare un'immagine termica della pelle piatta.<ol>
<li>Impostare il valore di emissività31 su 0,95 prima di scattare l'immagine termica.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere la pelle dalla schiuma e scattare immediatamente un'immagine termica del set-up senza la pelle piatta sulla schiuma. Questo quantifica la temperatura sulla superficie del vetro acrilico e calibra l'area della fonte di calore con l'area di misurazione sulla pelle piatta.<ol>
<li>Qui, l'emissività del vetro acrilico utilizzato30 è 0,86. Assicurati di registrarlo nel software della termocamera prima di scattare la foto senza la pelle. NOTA: La temperatura visualizzata dal bagno di acqua calda non è necessariamente la temperatura sulla superficie del vetro acrilico (Figura 3), poiché la sua conduttanza termica non è perfetta. L'uso della temperatura del vetro riduce gli errori nella stima di quanto sia calda la parte inferiore della pelle, ed è quindi una stima combinata di quanto calore viene perso attraverso la pelle e le piume.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimettere la pelle sulla schiuma nella stessa posizione. Ripetere i passaggi 2.5–2.6 per un totale di cinque prove.<ol>
<li>Per posizionare correttamente la pelle del campione, toccare delicatamente le piume nell'area di misurazione target con un polpastrello, quindi rimuovere il dito e visualizzare l'immagine termica. Il calore residuo del dito rimarrà brevemente visibile sull'immagine termica. Verificare che l'area di campionamento si trova all'interno del cerchio visibile disegnato nel software, che rappresenta l'area di calore irradiata attraverso la pelle dal bagno di acqua calda. In caso contrario, spostare la pelle fino a quando non lo è. Questo processo è illustrato nella Figura 2. NOTA: Mentre le pelli fresche (quando disponibili) possono rappresentare più da vicino le prestazioni termiche naturali della pelle in un uccello vivente, l'uso di pelli secche per queste misurazioni consente risultati comparabili e ripetibili su un pool molto più ampio di campioni. Pertanto, tutte le misurazioni devono essere effettuate utilizzando pelli essiccate a peso costante o sia sulla pelle fresca che su quella secca dei campioni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Raccolta di dati da immagini termiche
<ol><li>Ogni misurazione è costituita da due immagini termiche: una della pelle piatta e una del vetro acrilico. Innanzitutto, apri l'immagine del vetro acrilico. Allineare il cerchio disegnato nel software con il foro nella schiuma visibile nell'immagine. Registrare il valore della temperatura al centro del cerchio. NOTA: Per maggiori dettagli sull'estrazione di dati da immagini termiche, vedere Senior et al.36.<ol>
<li>Assicurarsi di calibrare la fotocamera con i valori corretti. Impostare l'emissivitàda 30 a 0,86 e impostare la temperatura ambiente e l'umidità in modo che corrispondano alle condizioni attuali in laboratorio, prima di registrare il valore della temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aprire l'immagine termica della pelle piatta. Senza spostare il cerchio, registrare il valore della temperatura al centro del cerchio. NOTA: poiché il cerchio non è registrato nell'immagine, è importante calibrare il posizionamento del cerchio con l'immagine del vetro acrilico scattata nella sezione 2.6.<ol>
<li>Assicurarsi di calibrare la fotocamera con i valori corretti. Impostare l'emissivitàda 31 a 0,95 e assicurarsi di impostare la temperatura ambiente e l'umidità in funzione delle condizioni correnti in laboratorio, prima di registrare il valore della temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.1–3.2 per tutte le misurazioni di tutti i campioni.</li>
</ol>4. Calcolo delle prestazioni termiche
<ol><li>Sottrarre la temperatura della superficie del rivestimento di piume dalla temperatura del vetro acrilico. Questo valore rappresenta il calore trattenuto dal mantello di piume.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento fornisce un protocollo per misurazioni termografiche ripetibili e standardizzate di campioni di pelle piatta aviaria. Questo metodo consente di confrontare le prestazioni termiche del mantello di piume tra specie, all'interno di specie, tra individui comparabili e in diverse posizioni sui corpi degli individui, il tutto senza distruzione del campione.
La disponibilità di materiali e attrezzature necessari può essere una limitazione di questo metodo. Sebbene le telecamere termiche stiano rapidamente diventando più accessibili e convenienti, le telecamere termiche di livello di ricerca costano ancora decine di migliaia di dollari37. Tuttavia, le termocamere possono essere utilizzate per molte applicazioni pratiche in biologia. McCaffery sostiene l'uso di telecamere termiche per indagare su questioni ecologiche28. Le termocamere sono particolarmente utili per la raccolta di dati sugli organismi viventi liberi sul campo perché sono strumenti a lunga distanza e non invasivi. Il metodo qui presentato rende possibile l'integrazione di studi sul campo e di laboratorio con misurazioni nelle stesse unità, eseguite dalla stessa apparecchiatura.
L'uso di software per termocamere diverso da quello qui utilizzato può richiedere modifiche a questo protocollo, ma tali modifiche interesseranno solo la fase di configurazione (sezione 1). Studi di uccelli più piccoli o alcune domande su specie più grandi di uccelli possono richiedere fori di dimensioni diverse nello strato di schiuma.
Allo stesso modo, la temperatura del bagno di acqua calda (fase 2.1) potrebbe richiedere modifiche per alcune specie con temperature interne più alte o più basse se l'obiettivo è misurare le temperature con rilevanza biologica diretta per la questione sperimentale. In generale, la standardizzazione della temperatura del bagno d'acqua a 40 °C attraverso gli studi faciliterà l'analisi comparativa delle prestazioni termiche relative di diversi tipi di piumaggio intatto e strutture di piume. Se è richiesta una misurazione precisa del flusso di energia attraverso la pelle e le piume, il metodo della piastra calda custodita11,12,13,28 è probabilmente un approccio migliore, poiché 1) elimina l'aria tra la fonte di calore e la pelle e 2) misura direttamente la temperatura sulla superficie interna della pelle. Tuttavia, sebbene questo metodo non misuri o calcoli direttamente il trasferimento di energia, è progettato per facilitare misurazioni rapide e ripetibili di campioni interi. Infine, i risultati dimostrano un'ampia precisione nel rilevare modelli di variazione delle prestazioni termiche del piumaggio.
Questo metodo utilizza pelli piatte, che attualmente non sono ampiamente disponibili nella maggior parte delle collezioni museali. Le pelli rotonde, che sono abbondantemente disponibili nella maggior parte delle collezioni di storia naturale, potrebbero essere utilizzate con questo metodo se smontate, ammorbidite, appiattite e ridisebitate. Tuttavia, è improbabile che i curatori approvino tale rimontaggio nella maggior parte dei casi. Per aumentare le risorse per gli studi comparativi dei valori termici delle piume degli uccelli, sosteniamo l'adozione diffusa della scuoiatura piatta nel maggior numero possibile di specie. Ulteriori vantaggi della scuoiatura piatta sono che le pelli piatte non richiedono la distruzione parziale dello scheletro e della muscolatura di un campione che la scuoiatura rotonda fa, e un numero maggiore di pelli piatte può essere conservato nello stesso spazio richiesto dalle pelli rotonde.
Nelle pelli di qualsiasi specie particolare, è essenziale sviluppare una tecnica per posizionare accuratamente la pelle nello stesso punto sopra il foro di calore ogni volta. I risultati qui ottenuti suggeriscono che la tecnica (come descritto nel passaggio 2.7) riduce al minimo l'errore di misurazione in modo più rapido ed efficace rispetto alla pratica nel solo posizionamento della pelle. Tuttavia, è plausibile che piumaggio particolarmente denso (ad esempio, pinguini11) potrebbero non perdere calore sufficiente attraverso le piume per rendere possibile visualizzare i fori di calore attraverso la pelle e le piume sull'immagine termica.
A causa della presenza di pterili nella maggior parte delle specie di uccelli, la disposizione delle piume sulla pelle su un esemplare influenzerà il modello di trasferimento di calore attraverso il mantello di piume. Pertanto, è importante che le piume siano posizionate il più vicino possibile alla loro posizione naturale in un uccello vivo. Preening le piume in una posizione ordinata e naturale è l'ultimo passo nel protocollo per la scuoiatura piatta di un campione29. Pertanto, se gli esemplari sono preparati correttamente, il posizionamento delle piume dovrebbe essere appropriato per le specie tra gli esemplari. La quantità di ptiloerection delle piume influenzerà anche le prestazioni termiche del mantello di piume intrappolando l'aria isolante nel mantello di piume. Al contrario, negli esemplari dalla pelle piatta, le piume giovano piatte sulla pelle29, quindi la ptiloerezione dovrebbe essere effettivamente comparabile tra tutti gli esemplari.
Sebbene questo studio si concentri sugli uccelli, questo metodo può essere ugualmente utile per le pelli di mammifero. Boonstra et al. hanno affermato che le piume degli uccelli sono più isolanti della pelliccia di mammifero, ma questo studio era una valutazione qualitativa basata sull'analisi visiva dei video termici39 piuttosto che una misura quantitativa del calore che fuoriesce da aree corporee comparabili. Si ritiene che il metodo qui descritto contribuirà ad un'espansione della ricerca termica comparativa e produrrà una grande comprensione dell'evoluzione e dell'ecologia delle strutture termoregolatrici come le piume40.

Le piume sono la caratteristica distintiva degli uccelli e svolgono molte funzioni, tra cui la più cruciale è l'isolamento1. Gli uccelli hanno le temperature medie più alte di qualsiasi gruppo di vertebrati e le piume che li isolano dai cambiamenti di temperatura ambientale sono una parte vitale del bilancio energetico, specialmente in ambienti freddi2. Nonostante l'importanza delle piume, la maggior parte della letteratura sui cambiamenti nelle condizioni termiche negli uccelli si è concentrata sullerisposte metaboliche alla variazione di temperatura piuttosto che sulla funzione delle piume come isolamento3,4,5,6,7,8,9,10 (per ulteriori dettagli, fare riferimento a Ward et al.) 11,12,13. Tuttavia, le piume stesse possono variare nel tempo, negli individui e nelle specie.
Il metodo qui presentato è utile per quantificare il valore termico complessivo del solo piumino. Rimuove i fattori confondenti negli uccelli vivi, come la termoregolazione comportamentale1 e quantità variabili di grasso isolante. Una misurazione più diffusa delle prestazioni termiche dei cappotti di piume è necessaria per migliorare la comprensione di come le piume contribuiscono all'isolamento e di come questo varia tra e all'interno delle specie durante la storia della vita di un uccello e il ciclo annuale.
Le piume isolano gli uccelli intrappolando l'aria sia tra la pelle e le piume che all'interno delle piume e creano una barriera fisica alla perdita di calore14. Le piume sono costituite da un albero di piume centrale, chiamato rachide, con proiezioni chiamate barbe14. I barbuli sono piccole proiezioni secondarie su barbe che si incastrano con barbe adiacenti insieme per "chiudere" la piuma e darle struttura. Inoltre, le piume in piuma mancano di un rachide centrale e hanno pochi barbuli, formando quindi una massa sciolta e isolante di barbe sulla pelle14. I cappotti di piume variano tra le specie15,16,all'interno delle specie17,18e all'interno di individui comparabili2,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, ci sono poche informazioni quantitative su come le variazioni nel numero di piume, l'abbondanza relativa di diversi tipi di piume su un uccello o i cambiamenti nel numero di barbe / barbule influenzano le prestazioni termiche complessive di un mantello di piume. Studi precedenti si sono concentrati sulla determinazione di un singolo valore medio di isolamento e conducibilità termica per una data specie11,12,13.
Il mantello di piume è noto per variare tra le specie. Ad esempio, la maggior parte degli uccelli ha aree distinte di pelle da cui le piume crescono, o meno, chiamate pterile e apteria, rispettivamente14. Il posizionamento delle pterile (a volte chiamate "tratti di piume") varia tra le specie e ha un certo valore come carattere tassonomico14. Tuttavia, alcuni uccelli (cioè ratiti e pinguini) hanno perso questa pterilosi e hanno una distribuzione uniforme di piume in tutto il corpo14. Inoltre, specie diverse, in particolare quelle che abitano ambienti diversi, hanno proporzioni diverse di tipi di piume15. Ad esempio, gli uccelli che abitano climi più freddi hanno più piume15 e piume di contorno con una porzione plumulacea più grande16 rispetto alle specie che abitano ambienti più caldi.
La microstruttura di alcuni tipi di piume può anche avere un effetto sull'isolamento tra le specie25,26. Lei et al. hanno confrontato la microstruttura delle piume di contorno di molti passeriformi cinesi e hanno scoperto che le specie che abitano ambienti più freddi hanno una percentuale maggiore di barbe plumulacee in ogni piuma di contorno, barbuli più lunghi, densità di nodi più elevata e nodi più grandi rispetto alle specie che abitano ambienti più caldi25. D'alba et al. hanno confrontato la microstruttura delle piume di edredoni comuni (Somateria mollissima) e oche graylag (Anser anser) e hanno descritto come queste differenze influenzino sia la capacità coesiva delle piume che la capacità delle piume di intrappolare l'aria26. I dati comparativi quantitativi su come queste variazioni nelle piume influenzano le prestazioni termiche complessive del mantello di piume tra le specie sono limitati (per maggiori dettagli, fare riferimento a Taylor e Ward et al.) 11,13.
All'interno di una specie, le prestazioni termiche del piumino possono variare. Alcune specie, come il parrocchetto monaco (Myiopsitta monachus)17, abitano areale geografiche molto ampie e diversificate. I diversi stress termici posti da questi diversi ambienti possono influenzare i mantelli di piume degli uccelli all'interno di una specie a livello regionale, ma attualmente non ci sono dati disponibili su questo argomento. Inoltre, Broggi et al. hanno confrontato due popolazioni di cinciallegre (Parus major L.) nell'emisfero settentrionale. Hanno dimostrato che le piume di contorno della popolazione più settentrionale erano più dense ma più corte e meno proporzionalmente plumulacee di quelle della popolazione più meridionale. Tuttavia, queste differenze sono scomparse quando gli uccelli di entrambe le popolazioni sono stati allevati nello stesso luogo18.
Inoltre, Broggi et al. hanno spiegato questi risultati come una risposta plastica a diverse condizioni termiche, ma non hanno misurato i valori di isolamento di questi diversi cappotti di piume18. I risultati suggeriscono anche che la densità delle piume di contorno è più importante per l'isolamento rispetto alla proporzione di barbe plumulacee nelle piume di contorno, ma Broggi et al. hanno suggerito che le popolazioni settentrionali potrebbero non essere in grado di produrre piume ottimali a causa della mancanza di nutrienti adeguati18. Misurazioni quantitative delle prestazioni termiche complessive di questi cappotti di piume favorirebbero la comprensione del significato delle differenze di piumaggio.
Nel corso del tempo, i cappotti di piume dei singoli uccelli variano. Almeno una volta all'anno, tutti gli uccelli muta (sostituire tutte le loro piume)19. Con il passare dell'anno, le piume si consumano2,20 e meno numerose18,21,22,23. Alcuni uccelli muta più di una volta all'anno, dando loro più cappotti di piume distinti ogni anno19. Middleton ha dimostrato che i cardellini americani (Spinus tristis), che muta due volte l'anno, hanno un numero maggiore di piume e una percentuale maggiore di piume lamentose nel loro piumaggio di base nei mesi invernali rispetto al loro piumaggio alternato durante i mesiestivi 24. Queste differenze annuali nel mantello di piume possono consentire agli uccelli di conservare più calore durante i periodi più freddi passivamente o di perdere più calore passivamente durante le stagioni calde, ma nessuno studio lo ha testato in modo conclusivo.
Sebbene gli uccelli termoregolano comportamentalmente1,27 e possano acclimatarsi metabolicamente a diverse condizioni termiche3,4,5,6,7,8,9,10,26, le piume svolgono un ruolo importante nella termoregolazione fornendo uno strato costante di isolamento. Il metodo qui descritto è progettato per rispondere a domande sul solo mantello di piume e sul suo ruolo nella termoregolazione passiva (cioè, quanto calore trattiene un uccello vivente senza modificare il suo comportamento o metabolismo?) isolando le piume. Mentre la termoregolazione attiva e fisiologica è ecologicamente importante, è anche importante capire come le piume da sole aiutano nell'isolamento e come influenzano la necessità di una termoregolazione comportamentale e fisiologica attiva.
Studi precedenti hanno stabilito metodi per quantificare la conduttività termica e l'isolamento termico delle pelli animali11, 12,13,28. Il metodo qui presentato è un'estensione del metodo "piastra calda custodita"11,12,13,28. Tuttavia, il metodo qui descritto misura la temperatura al confine esterno del mantello di piume utilizzando una termocamera, piuttosto che termocoppie. Il metodo della piastra calda protetta fornisce stime molto precise del flusso di energia attraverso una pelle, ma richiede la costruzione di una piastra calda multi-materiale, una certa familiarità con l'uso di termocoppie e termopale e l'uso distruttivo di una pelle che deve essere tagliata in piccoli pezzi. Questi pezzi vengono quindi ingrassati per eliminare l'aria tra il campione e l'apparato a piastra calda. Con l'eccezione dei pochi uccelli che mancano di apteria (ad esempio, pinguini), tagliare piccoli quadrati dalle pelli di uccello è problematico per scopi comparativi, poiché la posizione del taglio ha grandi effetti sul numero di piume effettivamente attaccate (e sovrasocie) alla pelle. Questo problema è esacerbato dalla variazione tra i taxa in presenza, dimensione e posizionamento di ptyerlae14.
Inoltre, mentre gli esemplari museali possono essere una risorsa potenzialmente ricca per valutare la variazione dell'isolamento tra gli uccelli, in generale, il permesso di tagliare e ungere campioni di pelle nelle collezioni scientifiche è irraggiungibile. Inoltre, gli esemplari prelevati dall'ambiente naturale per misurazioni di piastre calde custodite non possono essere successivamente utilizzati come campioni museali. Il metodo qui presentato differisce dal metodo della piastra calda custodita in quanto può essere utilizzato con pelli di uccelli intere essiccate, senza 1) richiedere la distruzione del campione e 2) ungere la parte inferiore della pelle. Utilizza telecamere termiche, che sono sempre più convenienti (anche se ancora relativamente costose), precise e utilizzate per le misurazioni di relazioni termiche di uccelli vivi.
Questo metodo non misura il flusso di energia (e quindi la conduttività termica o il valore di isolamento) attraverso la pelle e le piume direttamente come fa il metodo della piastra calda protetta. Invece, misura la temperatura al confine esterno di un cappotto di piume usando una telecamera termica. I valori risultanti rappresentano una misura integrata del calore perso passivamente attraverso la pelle, le piume e l'aria intrappolata tra di loro (rispetto a una fonte di calore sottostante). I campioni preparati come pelli piatte e misurati utilizzando la tecnica descritta possono essere conservati in collezioni e fornire indefinitamente valore per la ricerca futura. Questo metodo fornisce un modo standardizzato, comparabile e relativamente semplice per misurare le prestazioni termiche del mantello di piuma in qualsiasi campione dalla pelle piatta, che è particolarmente utile nei confronti inter- e intra-specifici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>109000831</td>
			<td>30 square ft.; this exact model need not be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Core Board</td>
			<td>Foamular</td>
			<td>20WE</td>
			<td>1 in. x 4 ft. x 8 ft; this exact model need no be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Water Bath</td>
			<td>PolyScience</td>
			<td>WB02</td>
			<td>Ambiet +5 &#176;C to 100 &#176;C; &#177;.01 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDF Data logger</td>
			<td>Elitech</td>
			<td>RC-51H</td>
			<td>Built in temperature and humidity sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass</td>
			<td>AdirOffice</td>
			<td>1212-3-C</td>
			<td>Acrylic glass; 12 in. x 12 in. x 1/8 in.; this exact model need not be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Image Analysis Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>ResearchIR Max v4.40.7.26 (64-bit)</td>
			<td>Allows collection of precise, quantitative thermal data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Imaging Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>SC655</td>
			<td>680x480-pixel resolution, &#177;2 &#176;C or &#177;2% accuracy, 40 cm minimum focusing distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod</td>
			<td>The Audubon Shop</td>
			<td>The Birder Tripod with Manfrotto 700RC2 Rapid Release Head</td>
			<td>65&#34; maximum height; this exact model need not be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a thermal camera to measure heat loss through bird feather coats

Le piume sono essenziali per l'isolamento, e quindi per il costo della termoregolazione, negli uccelli. Esiste una solida letteratura sul costo energetico della termoregolazione negli uccelli in una varietà di circostanze ecologiche. Tuttavia, pochi studi caratterizzano il contributo delle sole piume alla termoregolazione. Diversi studi precedenti hanno stabilito metodi per misurare il valore di isolamento delle pelli di animali, ma richiedono metodi di campionamento distruttivi che sono problematici per gli uccelli, le cui piume non sono distribuite uniformemente sulla pelle. Sono necessarie ulteriori informazioni su 1) come il contributo delle piume alla termoregolazione varia sia tra le specie che all'interno delle specie e 2) su come i cappotti di piume possono cambiare nello spazio e nel tempo. Qui è riportato un metodo per misurare rapidamente e direttamente le prestazioni termiche dei cappotti di piume e della pelle utilizzando campioni di pelle intera essiccati, senza la necessità di distruggere il campione di pelle. Questo metodo isola e misura il gradiente termico attraverso un mantello di piume in un modo che le misurazioni della perdita di calore e del costo metabolico negli uccelli vivi, che utilizzano strategie comportamentali e fisiologiche per termoregolarsi, non possono. Il metodo utilizza una telecamera termica, che consente la rapida raccolta di dati termici quantitativi per misurare la perdita di calore da una fonte stabile attraverso la pelle. Questo protocollo può essere facilmente applicato a varie domande di ricerca, è applicabile a qualsiasi taxa aviario e non richiede la distruzione del campione di pelle. Infine, favorirà la comprensione dell'importanza della termoregolazione passiva negli uccelli semplificando e accelerando la raccolta di dati quantitativi.

I risultati rappresentativi di una serie di un individuo di ciascuna delle cinque specie, misurati a sei temperature, sono presentati nella Figura 4 e nella Figura 5. Questi mostrano che piccole variazioni nel posizionamento della pelle possono comportare variazioni nelle letture fino a 1,7 °C. La Figura 4 mostra come la formazione di un investigatore aumenta la ripetibilità delle misurazioni. Ad esempio, lo stesso passero domestico individuale (Passer domesticus) è stato misurato cinque volte a una singola temperatura target da un investigatore inesperto (Figura 4A). Dopo l'addestramento su una varietà di esemplari di specie diverse, un investigatore (J.G.) ha misurato lo stesso campione cinque volte alla stessa temperatura target (Figura 4B). La stima del rapporto tra la temperatura del vetro acrilico e la temperatura sulla superficie delle piume è cambiata solo di una piccola (ma forse importante) quantità. Di conseguenza, la ripetibilità delle misurazioni stesse è cambiata di quasi quattro volte. La pratica ripetuta è quindi altamente raccomandata per gli operatori su una pelle non campione (prima di effettuare misurazioni che verranno analizzate) fino a quando le misurazioni convergono e la variazione delle misurazioni si stabilizza (cioè, nessun ulteriore miglioramento della riproducibilità è visto con ulteriore pratica). Questo è importante da ottenere prima di condurre analisi su misure ripetute (o la media di misure ripetute) in ciascun campione.
I dati mostrati nella Figura 5 rappresentano un piccolo campione pilota, ma suggeriscono che questo metodo per misurare le prestazioni termiche del mantello di piume probabilmente produrrà importanti informazioni sull'ecologia termica degli uccelli. Per ridurre l'errore di misurazione, solo uno sperimentatore (J.G.) ha addestrato e preso le misurazioni. Sebbene questi dati rappresentino solo un singolo individuo di ciascuna delle specie elencate (passero domestico, febe orientale [Sayornis phoebe], uccello gatto grigio [Dumetella carolinensis], uccello azzurro orientale [Sialia sialis], e cinciallegra trapuntata [Baeolophus bicolor]), la variazione delle pendenze dei dati risultanti dimostra che le prestazioni termiche dei cappotti di piume variano tra questi individui. Inoltre, l'entità di queste differenze suggerisce che la variazione potrebbe essere dovuta a differenze di specie.
Inoltre, dato che un singolo investigatore addestrato ha eseguito tutte le misurazioni nella Figura 5,l'abilità dello sperimentatore da sola non controlla la variazione dei valori R2. Ad esempio, è stato particolarmente difficile ottenere misurazioni ripetutamente nel passero domestico, anche dopo l'addestramento, rispetto alla febe orientale e all'uccello azzurro orientale (Figura 4, Figura 5). Gli ultimi due uccelli erano entrambi individui dell'anno da cova. Pertanto, la loro classe di età potrebbe influenzare l'uniformità del loro isolamento (anche se, questa è una speculazione senza ulteriori studi), ma non c'è motivo di aspettarsi che il posizionamento delle loro pelli per la misurazione dovrebbe essere più facile da ripetere rispetto a quello del passero domestico. Pertanto, alcuni cappotti di piume non completamente compresi nel passero domestico potrebbero richiedere ulteriori indagini. Allo stesso modo, la variazione delle pendenze delle linee nella Figura 5 suggerisce che la misurazione delle prestazioni termiche attraverso intervalli di temperatura (ad esempio, la zona termoneutrale di una specie) può essere biologicamente più informativa rispetto all'utilizzo di un singolo livello di calore di riferimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60981/60981fig01.jpg"> Figura 1: Schema dell'allestimento completo della termocamera e del bagno di acqua calda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60981/60981fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60981/60981fig02.jpg"> Figura 2: Immagini termiche che rappresentano un metodo per replicare lo stesso posizionamento su più prove. L'ellisse è già stata posizionata sull'area riscaldata sul vetro acrilico. Queste immagini mostrano il movimento della pelle e non l'ellisse. Toccare delicatamente e brevemente la punta di un dito sull'area di misurazione target sul mantello di piume. La punta delle dita lascerà un segno di calore sulla pelle per alcuni secondi. (A) Viene mostrato il segno di calore al di fuori dell'ellisse, il che significa che l'area di misurazione target non è esposta al calore. Facendo attenzione a non spostare la schiuma o il vetro acrilico (questo farebbe sì che l'ellisse rappresenti in modo impreciso l'area di esposizione al calore), regolare il posizionamento della pelle piatta e toccare nuovamente l'area di misurazione target. Continuare questo processo fino a quando (B) il segno di calore è contenuto all'interno dell'ellisse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60981/60981fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60981/60981fig03.jpg"> Figura 3: Relazione tra la temperatura del bagno di acqua calda (lettura del display) e la temperatura sulla superficie del vetro acrilico (ad esempio, la fonte di calore effettiva a cui è esposta la pelle piatta). Va notato che la temperatura sulla superficie del vetro acrilico è costantemente leggermente superiore alla temperatura visualizzata dal bagno di acqua calda. Utilizzare questa figura solo per comprendere questa relazione e misurare sempre la temperatura sulla superficie del vetro acrilico per ogni prova (sezione 2.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60981/60981fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60981/60981fig04.jpg"> Figura 4: Miglioramento della ripetibilità delle misurazioni della temperatura sulla superficie di un mantello di piume in un singolo uccello. Questi valori sono stati ottenuti da un singolo passero domestico (A) prima e (B) dopo l'addestramento di ripetibilità da parte dello sperimentatore per le prestazioni di misurazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60981/60981fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60981/60981fig05.jpg"> Figura 5: Relazione tra la temperatura sulla superficie del vetro acrilico e la temperatura sulla superficie della piuma in singoli esemplari di cinque specie di uccelli. I punti su ogni singolo grafico rappresentano misurazioni ripetute nello stesso individuo a sei diverse temperature target. Va notato che, sebbene le misurazioni al punto di riscaldamento di riferimento di 40 °C siano simili, la pendenza di queste linee varia. Ciò suggerisce che le prestazioni termiche dei cappotti di piume in questi uccelli differiscono (con una pendenza di 0 che è un isolante perfetto e una pendenza di 1 che è completamente non isolante). Va anche notato che la ripetibilità della misurazione varia. Anche dopo l'addestramento alla misurazione dello sperimentatore, la varianza nelle misure ripetute è più alta per il passero domestico e più bassa per la febe orientale e l'uccello azzurro orientale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60981/60981fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Questo protocollo descrive la quantificazione della trasmissione del calore attraverso un campione aviario dalla pelle piatta utilizzando una telecamera termica e un bagno di acqua calda. Il metodo consente di ottenere dati quantitativi e comparativi sulle prestazioni termiche dei cappotti di piume tra le specie utilizzando campioni di pelle piatta essiccati.

Utilizzo di una termocamera per misurare la perdita di calore attraverso i cappotti di piume di uccello

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...

using-a-thermal-camera-to-measure-heat-loss-through-bird-feather-coats

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

3.4K Views.  University of Connecticut. Questo protocollo descrive la quantificazione della trasmissione del calore attraverso un campione aviario dalla pelle piatta utilizzando una telecamera termica e un bagno di acqua calda. Il metodo consente di ottenere dati quantitativi e comparativi sulle prestazioni termiche dei cappotti di piume tra le specie utilizzando campioni di pelle piatta essiccati.

Video: Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Ricerca

Biologia

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Preparazione di Qualità pirofosfati Inositolo

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Su larga scala Knockdown Gene in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nuova tecnica di analisi quantitativa di perdita dei capelli nei topi mediante analisi in scala di grigi

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membrane lipidiche a doppio strato tethered per monitorare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro e membrane lipidiche

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...