Nosso protocolo fornece uma abordagem eficaz e repetível para avaliar e quantificar eventos fagocíticos em hemócitos. A principal vantagem dessa técnica é que podemos quantificar eventos fagocíticos dentro de hemócitos individuais que nos permitem detectar variações nos processos fagocíticos entre genótipos em moscas individuais. Realizar dissecções pode ser um desafio, por isso, ao realizar essa técnica pela primeira vez, pratique dissecções o máximo possível antes de realizar o procedimento completo.
Comece preparando agulhas de vidro para injeção. Encha uma seringa de um milímetro com óleo mineral e conecte a agulha hipodérmica de calibre 30 fornecida com o nano-injetor. Insira a agulha de calibre 30 na extremidade cega de uma agulha capilar puxada e encha-a com óleo mineral.
Remova lentamente a agulha de calibre 30 certificando-se de que não se formem bolhas de ar. Remova o collet e coloque o o-anel O selado com o recuo voltado para cima. Coloque o anel O maior sobre o êmbolo metálico e recoloque a collet sem apertar.
Insira o êmbolo metálico na extremidade contundente da agulha de vidro cheia de óleo e empurre-o suavemente para baixo, inserindo-o no anel O maior. Em seguida, aperte a collet até ficar em segurança. Depois de encher a agulha com partículas fluoro ou pH, injete as moscas na placa esternopleural do tórax.
A injeção é bem sucedida se o corante verde está indo para a mosca. Coloque as moscas injetadas em um novo frasco de comida observando a hora em que a primeira e última mosca foram injetadas. Coloque o frasco de lado até que todas as moscas se recuperem para evitar que grudem na comida.
Oriente o lado ventral da mosca sob um estereótipo dissetante. Em seguida, insira um pino de inseto no tórax e outro através da extremidade mais posterior do abdômen perto da genitália. Uma vez que todas as moscas tenham sido presas, use um pipet de transferência para adicionar mídia de dissecção suficiente para cobrir as moscas.
Remova a cabeça com uma tesoura de cutícula e faça uma incisão horizontal diretamente acima do pino posterior no abdômen, depois outra na extremidade mais anterior do abdômen. Faça uma incisão vertical conectando as duas incisões horizontais que abrirão a cavidade abdominal. Use fórceps para remover os órgãos internos e tecido, certificando-se de evitar o vaso dorsal.
Se necessário, use pinos adicionais para fixar as extremidades de corte da cutícula. Em seguida, remova o tórax com a tesoura da cutícula. Descarte a mídia de dissecção e substitua-a por um mililitro de 4%, protegendo as dissecções da luz o máximo possível.
Fixar as dissecções por 15 minutos em temperatura ambiente enquanto balança a 20 rpm. Em seguida, remova o fixador e adicione um mililitro de 1X PBST. Se desejar, manche as dissecções com anticorpos.
Depois de montar as cutículas em um slide de microscópio, use fórceps para orientá-los do lado ventral para cima, e certifique-se de que o vaso dorsal é visível. Moscas jovens e idosas foram avaliadas pela capacidade específica da idade de realizar fagocitose por imagem fluorescente de hemócitos ao longo do vaso dorsal. Um anticorpo contra pericártina foi usado para garantir que apenas células ao longo do vaso dorsal fossem contadas.
Uma vez que partículas E.coli fluorescentes são um micrômetro de comprimento e hemócitos têm 10 micrômetros de diâmetro, apenas eventos fluorescentes dentro de um diâmetro de 10 micrômetros centrados em um núcleo DAPI positivo foram contados. O software ImageJ foi então usado para quantificar os eventos. Ao tentar este procedimento, é importante visualizar que a mosca foi realmente injetada e lembrar que o tempo é crítico.
Completar injeções e dissecções em tempo hábil ajudará a minimizar erros experimentais e possíveis variações na taxa fagocítica. Essa técnica permitirá que os pesquisadores explorem uma variedade de tópicos de pesquisa, incluindo questões sobre imunidade celular, diferentes populações de células sanguíneas ou distinção da fagocitose da produção de AMP durante uma resposta imune bem sucedida.
