당사의 프로토콜은 혈청에서 phagocytic 이벤트를 평가하고 정량화하기 위한 효과적이고 반복가능한 접근 방식을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 혈청 세포 내에서 phagocytic 이벤트를 정량화할 수 있어 개별 파리의 유전자형 중 식세포 과정의 변화를 감지할 수 있다는 것입니다. 해부를 수행하는 것은 어려울 수 있으므로 이 기술을 처음 수행 할 때 전체 절차를 수행하기 전에 가능한 한 많은 해부를 연습하십시오.
먼저 주사를 위해 유리 바늘을 준비합니다. 1mm 주사기를 미네랄 오일로 채우고 나노 인젝터와 함께 제공되는 30 게이지 피하 바늘을 부착합니다. 30 게이지 바늘을 뽑아낸 모세관 바늘의 무딘 끝에 삽입하여 미네랄 오일로 채웁니다.
기포가 형성되지 않도록 30 게이지 바늘을 천천히 제거합니다. 콜릿을 제거하고 밀봉된 O 링에 들여쓰기를 향하게 합니다. 더 큰 O-링을 금속 플런저에 붙인 다음 조임 없이 콜릿을 다시 부착합니다.
금속 플런저를 오일로 채워진 유리 바늘의 무딘 끝에 삽입하고 부드럽게 더 큰 O 링에 삽입아래로 밀어 넣습니다. 그런 다음 콜릿을 고정할 때까지 조입니다. 플루오로 또는 pH에 민감한 입자로 바늘을 채운 후 흉부의 스테인럴 플레이트에 파리를 주입하십시오.
녹색 염료가 즉석로 들어가면 주사가 성공합니다. 주입 된 파리를 새로운 음식 유리병에 넣고 첫 번째와 마지막 비행이 주입 된 시간을 지적합니다. 모든 파리가 회복될 때까지 유리병을 옆에 놓아 음식에 갇히지 않도록 하십시오.
해부 스테레오 현미경 아래 플라이 복부 측면을 오리엔팅합니다. 그런 다음 흉부에 곤충 핀을 삽입하고 생식기 근처의 복부의 가장 후방 끝을 통해 다른 것을 삽입하십시오. 모든 파리가 고정되면 전송 파이프를 사용하여 파리를 덮을 충분한 해부 미디어를 추가하십시오.
큐티클 가위로 머리를 제거하고 복부의 후방 핀 바로 위에 수평 절개를 한 다음 복부의 가장 앞쪽 끝에 있는 다른 쪽을 만듭니다. 복강을 여는 두 개의 수평 절개를 연결하는 수직 절개를 합니다. 집게를 사용하여 내부 장기와 조직을 제거하여 등불 혈관을 피하십시오.
필요한 경우 추가 핀을 사용하여 큐티클의 절단 끝을 고정합니다. 그런 다음 큐티클 가위로 흉부를 제거합니다. 해부 매체를 폐기하고 4%의 PFA의 1밀리리터로 대체하여 해부를 가능한 한 빛으로부터 보호합니다.
20 rpm에서 흔들면서 실온에서 15 분 동안 해부를 수정하십시오. 그런 다음 고정을 제거하고 1X PBST의 1 밀리리터를 추가합니다. 원하는 경우, 항체와 해부를 얼룩.
현미경 슬라이드에 큐티클을 장착 한 후, 그들을 복부 측면을 방향을 구성하기 위해 집게를 사용하고 등쪽 용기가 보이는지 확인합니다. 젊고 숙성된 파리는 등대 혈관을 따라 혈구의 형광 화상 진찰에 의해 phagocytosis를 실행하는 연령 특정 능력에 대해 평가되었습니다. 페리카르딘에 대한 항체는 등대 혈관을 따라 세포만 계산되도록 하기 위해 사용되었다.
형광 표지E.coli 입자는 길이가 1 마이크로미터이고 혈구는 직경이 10 마이크로미터이기 때문에 DAPI 양성 핵을 중심으로 한 10 마이크로미터 직경 내에서 형광 이벤트만 계산되었습니다. ImageJ 소프트웨어는 이벤트를 정량화하는 데 사용되었습니다. 이 절차를 시도할 때, 비행이 실제로 주입되었다는 것을 시각화하고 타이밍이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
적시에 주사와 해부를 완료하면 식세포 속도의 실험 적 오류 및 가능한 변화를 최소화하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 연구원이 성공적인 면역 반응 도중 AMP 생산에서 세포 면역, 혈액 세포의 다른 인구 또는 구별하는 phagocytosis에 관하여 질문을 포함하여 다양한 연구 주제를 탐구하는 것을 허용할 것입니다.
