Наш протокол обеспечивает эффективный и повторяемый подход к оценке и количественной оценке фагоцитических событий в гемоцитах. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем количественно фагоцитических событий в отдельных гемоцитов, что позволяет нам обнаружить изменения в фагоцитических процессов среди генотипов у отдельных мух. Выполнение вскрытия может быть сложной задачей, поэтому при выполнении этого метода в первый раз, практика вскрытия как можно больше, прежде чем проводить полную процедуру.
Начните с подготовки стеклянных игл для инъекций. Заполните один миллиметр шприц с минеральным маслом, и приложите 30 калибровочных подкожной иглы при условии, с нано-инжектором. Вставьте 30 калибровочных игл в тупой конец вытащил капиллярной иглы и заполнить его с минеральным маслом.
Медленно удалите 30 калибровочных игл, убедившись, что пузырьки воздуха не образуются. Удалите коллет и поместите запечатанное O-кольцо с отступом вверх. Поместите больше O-кольцо на металлический поршень, а затем прикрепить коллет без затягивания.
Вставьте металлический поршень в тупой конец заполненной маслом стеклянной иглы и аккуратно нажмите его вниз, вставив его в большой O-кольцо. Затем затяните коллет до безопасного. После заполнения иглы флюоро или рН чувствительных частиц, вводить мух в стерноплеуральной пластины грудной клетки.
Инъекция успешна, если зеленый краситель идет в лету. Поместите инъекционных мух в новый пищевой флакон, увеяв время введения первой и последней мухи. Положите флакон на бок, пока все мухи не оправились, чтобы предотвратить их от застрять в пище.
Ориентируйте вентральную сторону мухи вверх под рассеченным стереомикроскопом. Затем вставьте булавку насекомого в грудную клетку, а другой через самый задний конец живота возле гениталий. После того, как все мухи были закреплены, используйте передачу пипетки, чтобы добавить достаточно препарации средств для покрытия мух.
Удалите голову ножницами кутикулы, и сделать горизонтальный разрез непосредственно над задней булавкой в животе, то другой в самом передней части живота. Сделайте вертикальный разрез, соединяющий два горизонтальных разреза, которые откроют брюшную полость. Используйте типсы для удаления внутренних органов и тканей, убедившись, что избежать спинного сосуда.
При необходимости используйте дополнительные булавки для защиты разрезанных концов кутикулы. Затем удалите грудную клетку ножницами кутикулы. Откажитесь от средств вскрытия и замените его на один миллилитр 4%PFA, защищая вскрытия от света как можно больше.
Исправить вскрытия в течение 15 минут при комнатной температуре при качания при 20 об/мин. Затем удалите фиксатор и добавьте один миллилитр 1X PBST. При желании испачкать вскрытия антителами.
После монтажа кутикулы на слайде микроскопа, используйте миппы, чтобы сориентировать их вентральную сторону вверх, и убедитесь, что спинной сосуд виден. Молодые и пожилые мухи оценивались на возрастную способность проводить фагоцитоз с помощью флуоресцентной визуализации гемоцитов вдоль спинного сосуда. Антитела против перикардина были использованы для обеспечения того, чтобы только клетки вдоль спинного сосуда были подсчитаны.
Поскольку частицы E.coli с люминесцентной маркировкой имеют один микрометр в длину, а гемоциты - 10 микрометров в диаметре, учитываются только флуоресцентные явления диаметром 10 микрометров, сосредоточенные на положительном ядре DAPI. Программное обеспечение ImageJ затем было использовано для количественной оценки событий. При попытке этой процедуры, важно визуализировать, что муха была на самом деле вводили и помнить, что сроки имеет решающее значение.
Своевременное завершение инъекций и вскрытий поможет свести к минимуму экспериментальную ошибку и возможные колебания фагоцитического курса. Этот метод позволит исследователям исследовать различные темы исследования, включая вопросы, касающиеся клеточного иммунитета, различных популяций клеток крови или различения фагоцитоза от производства AMP во время успешного иммунного ответа.
