הפרוטוקול שלנו מספק גישה יעילה וחוזרת על עצמה כדי להעריך ולמת אירועים phagocytic בהמוציטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לכמת אירועים phagocytic בתוך hemocytes בודדים המאפשר לנו לזהות וריאציות בתהליכים phagocytic בקרב גנוטיפים בזבובים בודדים. ביצוע ניתוחים יכול להיות מאתגר, ולכן בעת ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה, לתרגל ניתוחים ככל האפשר לפני ביצוע ההליך המלא.
התחל על ידי הכנת מחטי זכוכית להזרקה. מלא מזרק מילימטר אחד בשמן מינרלי, ולצרף את המחט hypodermic 30 מד מסופק עם מזרק ננו. הכנס את המחט 30 מד לתוך הקצה הקהה של מחט נימי משך ולמלא אותו בשמן מינרלי.
לאט להסיר את המחט 30 מד לוודא כי אין בועות אוויר נוצרים. הסר את הקולט והצב את ה- O-ring האטום כשהכניסה פונה כלפי מעלה. מניחים את ה-O-ring הגדול יותר על בוכנה מתכת, ולאחר מכן לחבר מחדש את הקולט מבלי להדק.
הכנס את בוכנה מתכת לתוך הקצה הקהה של מחט זכוכית מלא שמן בעדינות לדחוף אותו למטה החדרת אותו לתוך O-ring גדול יותר. ואז להדק את הקולט עד מאובטח. לאחר מילוי המחט עם פלואורו או חלקיקים רגישים pH, להזריק את הזבובים בצלחת sternopleural של בית החזה.
ההזרקה מוצלחת אם הצבע הירוק נכנס לטיסה. מניחים את הזבובים המוזרקים לתוך בקבוקון מזון חדש ומים לב לזמן שהטיסה הראשונה והאחרונה הוזרקו. הניחו את הבקבוקון על צידו עד שכל הזבובים יתאוששו כדי למנוע מהם להיתקע במזון.
כוון את הצד הגחוני של הזבוב למעלה תחת סטריאומיקרוסקופ ניתוח. ואז להכניס סיכת חרק לתוך בית החזה ועוד דרך הקצה האחורי ביותר של הבטן ליד איבר המין. לאחר שכל הזבובים הוצמדו, השתמש בצינור העברה כדי להוסיף מספיק מדיית ניתוח כדי לכסות את הזבובים.
הסר את הראש עם מספריים cuticle, ולעשות חתך אופקי ישירות מעל הסיכה האחורית בבטן, ואז עוד בקצה הראשון של הבטן. בצע חתך אנכי המחבר את שני החתכים האופקיים אשר יפתחו את חלל הבטן. השתמש מטלפים כדי להסיר את האיברים הפנימיים ואת הרקמה, הקפדה על הימנעות כלי הגב.
במידת הצורך, השתמשו בפינים נוספים כדי לאבטח את הקצוות החתוכים של החותך. לאחר מכן להסיר את בית החזה עם מספריים קוטיקל. השלך את מדיית הניתוח והחלף אותה במיליליטר אחד של 4%PFA, והגן על הניתוחים מפני אור ככל האפשר.
לתקן את הניתוחים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תוך נדנדה ב 20 סל"ד. לאחר מכן הסר את התיקון והוסף מיליליטר אחד של PBST 1X. אם תרצה, להכתים את הניתוחים עם נוגדנים.
לאחר הרכבה את cuticles על שקופית מיקרוסקופ, להשתמש מדפים לכוון אותם בצד הגחוני למעלה, ולוודא כי כלי הגב גלוי. זבובים צעירים ומבוגרים הוערכו על יכולת ספציפית לגיל לבצע phagocytosis על ידי הדמיה פלואורסצנטי של hemocytes לאורך כלי הגב. נוגדן נגד ורידים שימש כדי להבטיח כי רק תאים לאורך כלי הגב נספרו.
מכיוון שחלקיקי E.coli הנקראים פלואורסצנטיים הם מיקרומטר אחד באורך והמוציטים הם בקוטר של 10 מיקרומטר, נספרו רק אירועים פלואורסצנטיים בקוטר של 10 מיקרומטר שבמרכזם גרעין DAPI חיובי. תוכנת ImageJ שימשה אז לכימות האירועים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לדמיין כי הזבוב הוזרק למעשה ולזכור כי העיתוי הוא קריטי.
השלמת זריקות ותניתוכים בזמן תסייע למזער את השגיאה הניסיונית ואת הווריאציות האפשריות בקצב האפגוגיטי. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של נושאי מחקר כולל שאלות לגבי חסינות תאית, אוכלוסיות שונות של תאי דם או הבחנה בין phagocytosis מייצור AMP במהלך תגובה חיסונית מוצלחת.
