Name: phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos
Uploaded: 2017-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Agradecemos a Kaz Nagaosa e Akiko Shiratsuchi pelo seu conselho.

1. Preparação <ol><li> Preparação de placas de agar de suco de uva fresca <ol><li> Adicione 100 mL de água a 4,4 g de ágar e aquecer a mistura num forno de microondas para dissolver o ágar. </li><li> Adicione 80 mL de suco de uva fresco, 5 mL de ácido acético e 5 mL de solução de etanol em ágar. </li><li> Despeje aproximadamente 1,5 ml da solução com uma pipeta em cada lâmina de vidro e deixe solidificar. </li></ol></li><li> Preparação de placas de agarose de prato de 6 cm <ol><li> Adicionar 50 mL de água a 0,5 g de agarose e aquecer a mistura num forno de microondas para dissolver a agarose. </li><li> Despeje aproximadamente 2.5 mL de solução de agarose em um prato de 6 cm com uma pipeta. </li></ol></li></ol> 2. Coleção de embriões do estágio 16 <ol><li> Recolha moscas adultas e adicione 200 fêmeas e 200 machos a um tubo cônico de 50 mL. </li><li> Coloque um prato de agar de suco de uva fresco em fermento no tubo de 50 mL e feche com uma esponja caP. </li><li> Incube as moscas a 16 ° C na luz por 2 a 3 dias. Mude a placa uma vez por dia. </li><li> Mova as moscas para o escuro a 25 ° C durante 1 h. </li><li> Mude a placa velha para uma nova sem fermento. Deixe as moscas colocar ovos por 2 h. </li><li> Recolher a placa e incubar a 16 ° C por 26 h. </li><li> Coletar embriões da placa com um pincel em 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Lavar embriões duas vezes com 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Para remover o corion, adicione 1,2 ml de solução de hipoclorito de sódio (2,2 - 3,4% Cl) aos embriões durante 3 min. </li><li> Lavar embriões 4 vezes com 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Coloque os embriões em placas de agarose de prato de 6 cm. Pegue os embriões do estágio 16 sob um microscópio, conforme descrito por Roberts 20 . Recolher cerca de 50 embriões em um tubo de teste de Treff de 1,5 mL com uma micropipeta. </li></ol> 3. PrepaRação de células embrionárias <ol><li> Lavar embriões duas vezes com 150 μL de PBS. </li><li> Homogeneizar embriões 30 vezes em um tubo de teste micro e microondas de 1,5 mL na presença de 200 μL de colagenase (0,25% (p / v)) em PBS. </li><li> Disperse células embrionárias por pipetagem 10 vezes e mova a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL. Incubar células a 37 ° C durante 1 min num banho de água. Repita este passo duas vezes. </li><li> Adicione 800 μL de PBS à suspensão celular e centrifugue a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Remova o sobrenadante e adicione 200 μL de tripsina (0,25% (p / v)) em PBS às células. Disperse células embrionárias por pipetagem 50 vezes. </li><li> Filtra a suspensão celular com um filtro celular de 70 μm. </li><li> Para parar a actividade da tripsina, adicionar 40 μL de soro bovino fetal inactivado por calor à suspensão celular filtrada. Adicionar 800 μL de PBS e centrifugar a 1.400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Remova os supernatosNt, suspender células precipitadas em 200 μL de PBS e centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e suspender as células precipitadas em 30 μL de PBS. </li><li> Monte a suspensão celular preparada em lâminas de vidro revestidas com aminopropil trietoxissilano e aguarde 10 a 15 minutos até as células serem fixadas nas lâminas de vidro. </li><li> Remova a solução restante nas lâminas de vidro com uma pipeta. Monte 60 - 70 μL de PBS contendo 4% (p / v) de PFA (paraformaldeído) em células durante 10-15 min para fixação. </li><li> Remova a solução de fixação e coloque as lâminas de vidro em PBS por mais de 1 min. </li></ol> 4. Coloração de Hemócitos <ol><li> Imunossinção com um anticorpo anti-Croquemort <ol><li> Embeber em série lâminas de vidro em metanol durante 10 minutos, em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) durante 10 minutos e depois em PBS durante 10 min. </li><li> Monte 20 μL de soro de porco inteiro a 5% (v / v) em PBS contidaNg 0,2% (v / v) Triton X-100 em células para bloqueio. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Retire a solução de lâminas de vidro e monte 20 μL de antisoro anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) em células. Incubar as lâminas a 4 ° C durante a noite. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Empurrar lâminas de vidro em PBS por 10 min. </li><li> Monte 20 μL de IgG anti-rato marcado com fosfatase alcalina (0,5% (v / v)) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) e soro de porco inteiro a 5% (v / v) nas células na sala Temperatura durante 1 h. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Soak lâminas de vidro em tampão contendo Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM durante 10 min. </li><li> Solução de substrato de fosfatase de montagem contendo 0,23 mg / mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg / ml de nitro azul de tetrazólio (NBT), Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM em células. </li><li> Observe as células ao microscópio para coloração adequada. Quando os sinais roxos fortes aparecem nos grânulos de hemócitos, remova a solução de substrato e remova as lâminas de vidro em tampão consistindo em Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 e EDTA 1 mM. Recomenda-se a coloração de aproximadamente 5 a 10 min. </li></ol></li><li> Imunossinção com anticorpo anti-GFP (outra opção para a coloração de hemócitos) <ol><li> Embeber em série lâminas de vidro em metanol durante 10 min, PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min e PBS durante 10 min. </li><li> Monte 20 μL de soro de suco inteiro de 5% (v / v) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) em células para bloqueio. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Remova a solução em lâminas de vidro e monte 20 μL do anticorpo anti-GFP de mouse (1% (v / v)) / PBS cApresentando Triton X-100 a 0,2% (v / v) nas células. Incube as lâminas à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Empurrar lâminas de vidro em PBS por 10 min. </li><li> Monte 20 μL de IgG anti-rato marcado com fosfatase alcalina (0,5% (v / v)) em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 e 5% (v / v) de soro inteiro de suíno em células na sala Temperatura durante 1 h. </li><li> Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes. </li><li> Soak lâminas de vidro, em tampão que consiste em Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM durante 10 min. </li><li> Montar a solução de substrato de fosfatase contendo 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM em células. </li><li> Observe as células ao microscópio para coloração adequada. Quando os sinais roxos aparecem em hemócitos inteiros, remova a solução do substrato e remova as lâminas em tampãoDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 e EDTA 1 mM. Recomenda-se a coloração de aproximadamente 10 a 15 min. </li></ol></li></ol> 5. Mancha de células apoptóticas por TUNEL <ol><li> Empurre as lâminas de vidro em PBS por 5 min. </li><li> Repita com o novo PBS. </li><li> Mount Equilibration buffer (Ver Tabela de Materiais) em células durante 10 min. </li><li> Retire a solução de lâminas de vidro e monte 20 μL de solução de TdT contendo 5 μL de desoxinucleotidil transferase terminal e 15 μL de Tampão de Reação em células a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Remova a solução das lâminas de vidro e remova as lâminas em tampão, que consiste em 0,5 mL de STOP / tampão de lavagem e 17 mL de água. </li><li> Empurre as lâminas em PBS por 5 min 3 vezes. </li><li> Monte 20 μL de Anti-Digoxigenina-Peroxidase em células à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Empurre as lâminas de vidro em PBS por 5 min 4 vezes. </li><li> Embeber lâminas de vidro na solução de substrato de peroxidase consistindo em 30 mL de Tris-HCl 50 mM, contendo pH7,5E uma micro-espátula completa de tetra-hidrocloreto de 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) e 0,2% (v / v) de H 2 O 2 durante 30 s. </li><li> Repita o passo 5.9 até que as células apoptóticas sejam manchadas em marrom. Empurre as lâminas de vidro em água para parar a reação da peroxidase. </li><li> Anexe células com água para observação. </li></ol> 6. Medir o nível de fagocitose das células apoptóticas <ol><li> Observe amostras sob um microscópio de luz para avaliar o nível de fagocitose. Contagem de células positivas de Croquemort ou células GFP-positivas como hemócitos, células TUNEL-positivas como células apoptóticas e células positivas duplas como hemocitopes fagocitantes. </li><li> O índice fagocítico é definido como o número de células duplas positivas para o número total de células positivas para Croquemort ou células GFP positivas. Recomenda-se que mais de 300 hemócitos sejam observados. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<html> Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando embriões de Drosophila . Ao usar células embrionárias dispersas para medir a fagocitose quantitativamente, os hemócitos, os fagócitos profissionais de Drosophila , são imunossincionados para o marcador de hemicíticos Croquemort ou GFP dirigido por srpHemo , e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL neste protocolo. O nível de fagocitose é expresso como um índice fagocítico contando o número total de hemócitos e hemoc...

Em animais metazoários, por exemplo , o nematóide Caenorhabditis elegans , a mosca da fruta Drosophila melanogaster e os camundongos e os seres humanos, um grande número de células sofre apoptose durante o desenvolvimento para moldar seus corpos e na idade adulta para manter a homeostase 1 , 2 . As células apoptóticas precisam ser rapidamente removidas porque induzem inflamação nos tecidos circundantes, liberando materiais intracelulares imunogênicos, se não forem completamente removidos 3 . A fim de facilitar a remoção rápida, as células apoptóticas apresentam os chamados sinais de comer-me que são reconhecidos pelos receptores de engulfment de fagócitos e são eliminados por fagocitose 3 , 4 , 5 , 6 . Assim, a fagocitose desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do hospedeiro e, portanto, elucidando a molécula<html> Os mecanismos subjacentes à fagocitose das células apoptóticas são importantes. Os mecanismos responsáveis ​​pela fagocitose das células apoptóticas parecem ser conservados evolutivamente entre as espécies nos nematóides, moscas e camundongos 7 . Vários ensaios de fagocitose estão atualmente disponíveis para avaliar a absorção de células apoptóticas nestes animais modelo. Em C. elegans , 131 células somáticas sofrem morte celular programada durante o desenvolvimento, e cadáveres celulares são fagocitadas por células vizinhas, que são fagócitos não profissionais 8 . Assim, contar o número de cadáveres de células restantes em C. elegans indica o nível de fagocitose in vivo . Ao procurar por mutantes de nematóides que mostram um número aumentado de células mortas, vários genes necessários para a fagocitose foram identificados e caracterizados geneticamente 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Os ensaios de fagocitose ex vivo com fagócitos de cultura primária, geralmente macrófagos, são frequentemente utilizados em camundongos. As células apoptóticas são preparadas usando linhas celulares tais como células Jurkat e são misturadas com fagócitos primários. Após uma incubação por várias horas, o número total de fagócitos e fagócitos envolventes são contados para avaliar o nível de fagocitose. Como uma modificação sofisticada deste método, o grupo de Nagata desenvolveu um teste de fagocitose ex vivo com células que expressam um ICAD resistente a caspases (inibidor da DNase ativada por caspase), em que as células apoptóticas não sofrem fragmentação do DNA apoptótico, mas o DNA ainda é escorado quando As células são fagocitadas. Quando estas células são utilizadas como alvos apoptóticos num ensaio de fagocitose, apenas o ADN de células apoptóticas engolidas é fragmentado e corado por marcação de endereçamento DUTP mediada por TdT (TUNEL). Portanto, o leveL de engolimento de células apoptóticas é medido contando sinais de TUNEL em uma mistura de fagócitos e células apoptóticas 13 . Em D. melanogaster , fagócitos profissionais denominados hemócitos, macrófagos de Drosophila , são responsáveis ​​pela fagocitose das células apoptóticas 14 , 15 . Além dos ensaios de fagocitose in vitro com linhas celulares de cultura, estão disponíveis ensaios de fagocitose in vivo com embriões de Drosophila inteiros. Os embriões de Drosophila são uma poderosa ferramenta para examinar o nível de absorção de células apoptóticas porque muitas células sofrem apoptose e são fagocitadas por hemócitos durante o desenvolvimento embrionário 14 , 15 , 16 . Um exemplo de um teste de fagocitose in vivo é o método desenvolvido pelo grupo de Franc. No seu método, os hemócitos são deProtegido pela imunocoloração da peroxidasina, um marcador hemicítico, as células apoptóticas são coradas usando o corante nuclear, a 7-amino-actinomicina D em embriões de Drosophila inteiros, e o número de células positivas duplas é contado como um sinal de fagocitose 17 . Outro exemplo de um teste de fagocitose em embriões baseia-se no conceito do método de Nagata descrito acima; No entanto, a fagocitose in vivo é avaliada utilizando os embriões de DNC ( Drosophila caspase-activada DNase) moscas mutantes 18 , 19 . Estes ensaios de fagocitose in vivo são úteis para observar diretamente a fagocitose in situ . Contudo, as dificuldades estão associadas à exclusão de qualquer possível viés na etapa de contagem de células fagocitantes porque é difícil observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros devido à sua espessura. Para superar essa limitação, desenvolvemosUm novo teste de fagocitose em embriões de Drosophila . Em nosso método, para conter facilmente os hemocitros fagocitantes, os embriões integrais são homogeneizados para preparar células embrionárias dispersas. Os fagócitos são detectados pela imunocoloração de um marcador de fagócitos e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL com estas células embrionárias dispersas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro que quantificasse precisamente o nível de fagocitose. Todos os genótipos de moscas podem ser empregados neste ensaio se desenvolverem o estágio 16 de embriões 20 , o estágio de desenvolvimento no qual a depuração celular apoptótica por fagocitose é a mais abundante. Este método tem a vantagem de avaliar quantitativamente o nível de fagocitose e, portanto, pode contribuir para a identificação de novas moléculas envolvidas na fagocitose de células apoptóticas in vivo .

<table><tbody><tr><td>whole swine serum</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>For bloking</td></tr><tr><td>Treff micro test tube(easy fit)&amp;nbsp; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>pellet mixer&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>secondary antibody for&lt;br/&gt; stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-&lt;br/&gt; 3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Anti-Croquemort antibody</td><td></td><td></td><td>described previously in Manaka &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Anti-GFP&lt;br/&gt; from mouse IgG1&amp;kappa; (clones 7.1 and 13.1)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine&lt;br/&gt; tetrahydrichloride</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Fly Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock center&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock ID&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Control flies, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&lt;sup&gt;&amp;Delta;5&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>drpr mutant, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Itgbn mutant, described in Devenport &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>described in Br&amp;uuml;ckner &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td><td>4833</td><td>-</td></tr><tr><td>UAS-Itgbn-IR</td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

Os mecanismos moleculares subjacentes à fagocitose das células apoptóticas precisam ser esclarecidos com mais detalhes devido ao seu papel nas doenças imunes e inflamatórias intratáveis. Aqui desenvolvemos um método experimental para investigar a fagocitose quantitativamente usando a Drosophila da mosca da fruta, na qual a rede de genes que controla as reações de engulfment é conservada evolutivamente de mamíferos. A fim de detectar com precisão e contar fagócitos envolventes e não envolventes utilizando animais inteiros, os embriões de Drosophila foram homogeneizados para obter células dispersas, incluindo fagócitos e células apoptóticas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro em que seja possível observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros e quantificar com precisão o nível de fagocitose. Confirmamos que este método reproduz os de estudos préviosQue identificou os genes necessários para a fagocitose das células apoptóticas. Este método permite analisar a absorção de células mortas e, quando combinado com a poderosa genética da Drosophila , revelará as complexas reações fagocíticas que compõem a migração, reconhecimento, engolfamento e degradação de células apoptóticas por fagócitos.

Para examinar a fagocitose das células apoptóticas, os embriões de Drosophila do estádio de desenvolvimento 16 foram coletados e preparados como células dispersas. Hemocitus, macrófagos de Drosophila , foram corados por imunocitoquímica para o marcador de hemicíticos &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 usando um anticorpo específico 19 , 21 e as cél...

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

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Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

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9.8K visualizações.  Kanazawa University.  Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas. 

Vídeo: Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Imunologia e Infecção

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neurociência

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicina

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Biologia

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Source: Nazario-Toole, A. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59543">Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a fluorescence microscope.

Um ensaio in vivo para quantificar a fagocitose bacteriana em moscas Drosophila adultas

1. Prepare Fluorescein particles for injection

	Reconstitute 10 mg of commercially available, heat-killed bacteria particles labeled with fluorescein ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Imaging and Visualization Techniques

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. <a href="https://app.jove.com/v/56352">Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

O ensaio de fagocitose: uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias de Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining ...

Técnicas Biológicas

Técnicas de Ensaio

Ensaios baseados em células

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

Source: Taruc, K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58149">Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Source: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...