Métodos de cultura aprimorados para amostras de tumores derivados do paciente são criticamente importantes à medida que o campo se afasta do uso de linhas celulares convencionais. Este protocolo permite a cultura in vitro de células tumorais derivadas do paciente em uma plataforma que é favorável a alta produtividade e rastreamento de alto teor de conteúdo, ao contrário dos modelos de câncer in vivo. A plataforma que incorpora PDXs nos permite avaliar sistemas mais heterogêneos que refletem tumores nativos.
Isso pode produzir uma visão dos mecanismos de drogas e permitir uma triagem mais rápida de drogas. O método poderia ser expandido através da incorporação de estroma, endotélio e células imunes. Essas co-culturas poderiam ser ainda mais reflexivas da população e arquitetura de tumores nativos.
Pratique carregar as placas microfluidas com linhas celulares facilmente expandidas para se tornar altamente proficiente antes de mudar para células mais preciosas como PDXs. O alinhamento durante a distribuição de placas impacta muito o sucesso, e uma demonstração visual pode facilmente transmitir esse conceito. Para começar, transfira tecido tumoral para um tubo cônico pré-pesado de 50 mililitros.
Enxágüe seis vezes com 30 mililitros de PBS estéreis para remover sangue e contaminantes. Remova o máximo de líquido possível e pese o tecido tumoral. Transfira o tecido tumoral para um prato de cultura de tecido redondo de 60 milímetros, e use uma lâmina de barbear estéril ou um bisturi para pica-lo em pedaços de um milímetro.
Adicione cinco mililitros de meio de processamento PDX para coletar o chorume tumoral. Adicione cinco mililitros de solução de enzima dissociação para coletar o chorume tumoral. Enxágüe o prato de cultura com mais cinco mililitros de solução de enzima dissociação.
Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de processamento PDX. Incubar 20 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave. No meio do tempo de incubação, gire o tubo suavemente.
Após a incubação, pipeta para cima e para baixo suavemente com uma pipeta sorológica para quebrar aglomerados. Coloque um coador de células de 70 mícrons sobre um novo tubo estéril de 50 mililitros e filtre as células. Em seguida, centrífuga a 1.200 rpm por dois minutos para pelotar as células.
Remova o supernatante e resuspend em dois a três mililitros de meio de cultura PDX. Conte as células usando um hemócitometro ou contador de células automatizada. Use esta tabela para estimar o número necessário das células derivadas do PDX associadas necessárias para alcançar a densidade celular desejada por chip.
Placa de uma a duas vezes 10 para as seis células em cinco mililitros de cultura PDX médio por poço de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Incubar por 48 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade com agitação suave de 50 a 55 rpm para promover a formação de aglomerados. Depois que os clusters se formarem, prossiga para a centrifugação.
Primeiro prepare 20 mililitros de solução de gradiente de 100% de densidade misturando completamente 18 mililitros de solução de centrifugação de gradiente de densidade com dois mililitros de HBSS 10X estéril em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Diluir esta solução 100% com HBSS 1X estéril para fazer 10 mililitros cada um de 20%30%40% e 55% de soluções gradientes de densidade. Adicione três mililitros de solução gradiente de densidade de 55% ao fundo de um tubo cônico de 15 mililitros.
Segurando o tubo em um ângulo, dispense lentamente três mililitros de solução de gradiente de densidade de 40% para o lado angular do tubo e em cima da camada de 55%. Repita com a solução de gradiente de densidade de 30%. Em seguida, colete o supernatante das culturas de rotação PDX com uma pipeta sorológica de cinco mililitros em um tubo, enxaguando a superfície da placa suavemente.
Centrifugar a 1.200 rpm por dois minutos para as células de pelota. Remova o supernasciente e resuspense a pelota da célula em três mililitros de solução gradiente de densidade de 20%. Coloque cuidadosamente a solução gradiente de 20% de densidade com células na parte superior do gradiente no tubo de 15 mililitros.
Tampe os tubos e centrífuga em uma centrífuga de rotor de balde de balanço 30 minutos a quatro graus Celsius, 2.000 vezes G, e zero break. Após a centrifugação, frações são visíveis. Culturas viáveis de células PDX são tipicamente encontradas na interface de solução de gradiente de densidade de 40 a 55%.
Colete de dois a três mililitros de cada fração em tubos frescos de 15 mililitros. Adicione de três a quatro volumes de HBSS 1X estéreis a cada fração e inverta para misturar bem. Centrifugar a 1.000 vezes G por três minutos para pelotar as células.
Remova o supernatante. Resuspenda a pelota de célula em um a dois mililitros de meio de processamento PDX. Transfira uma pequena alíquota entre 50 a 100 microliters em um tubo e adicione um volume igual de solução de enzima dissociação para redissociação.
Avalie o número da célula na suspensão da célula agrupada. Conte as células com um hemócitometro ou contador de células automatizada. Reconstituir soluções de hidrogel de ácido hialurônico de acordo com as instruções do fabricante.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microliters de HBSS a todos os poços em colunas de janelas de observação de uma placa microfluidic de duas pistas para manter a umidade da cultura e condições ideais de imagem. Calcule o volume de suspensão celular necessário para 50 microliters de hidrogel na densidade celular desejada, por exemplo, 5.000 células por microliter. Para semear uma placa microfluida, aliquot o volume calculado em cada um dos quatro tubos de centrífuga de 1,5 mililitros estéreis.
Ajuste o pH da solução de thiol HA para oito com 1 hidróxido de sódio normal imediatamente antes de ser usado. Realize uma gelação de teste misturando 40 microliters de ha thiol com 10 microliters de PEGdA e monitorando a gelação ao longo do tempo. Em seguida, centrifugar as alíquotas de suspensão celular por dois minutos a 200 vezes G e temperatura ambiente para pelotar as células.
Remova cuidadosamente o supernascer e resuspenja as células em 40 microliters de ha thiol para um volume final de 50 microliteres. Adicione 10 microliters de PEGdA a uma alíquota das células de ha thiol. Misture bem, e espere de um a três minutos antes de semear a placa microfluida.
Afixe uma dica para distribuir 1,5 microliters a uma pipeta repetindo um único canal e carregue com as células na solução de hidrogel HA. Lembre-se de manter a alíquota de hidrogênio bem misturada para garantir a distribuição uniforme da célula. Para semear a placa microfluida, alinhe a ponta da pipeta perpendicular à lâmina enquanto coloque suavemente a ponta no centro da entrada de gel para garantir o contato, mas sem pressão ao dispensar 1,5 microliters da solução de hidrogel.
Observe o estado de preenchimento dos canais microfluidos visualizando a partir da parte superior da placa, parte inferior da placa ou por microscópio. Avalie o carregamento usando esta figura como guia. Um minuto após o carregamento, inverta a placa enquanto se prepara para a próxima alíquota.
Repita a semeadura da placa microfluida para as três alíquotas restantes das células na solução HA. Depois que todos os chips forem preenchidos, incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada 45 minutos até que a gelação esteja completa. Depois disso, utilizando o manual fornecido, certifique-se de que o roqueiro de perfusão esteja instalado na incubadora de cultura celular com a configuração correta de profusão em ângulo de 14 graus e intervalos de quatro minutos.
Adicione 50 microliters de cultura celular PDX ao meio de todas as entradas médias. Bata suavemente a placa contra uma superfície para incentivar o líquido a preencher os canais microfluidos. Em seguida, gire a placa para verificar se os canais estão preenchidos corretamente.
Adicione 50 microliters de DMEM/F-12 para todos os meios de comunicação. Se alguma bolha de ar estiver presa no canal de perfusão, remova por toques suaves da placa contra uma superfície. Usando um microscópio e um formulário de layout de placa, registo o sucesso do preenchimento do chip.
Exclua os chips mal preenchidos de uso experimental posterior. Coloque a placa em um roqueiro inclinado definido para uma inclinação de 14 graus e um ciclo de quatro minutos para começar a perfusão. A cada dois dias, substitua o meio de cultura PDX, primeiro 50 microliters nas entradas, depois 50 microliters nas tomadas.
Neste estudo, um roqueiro de perfusão programável foi instalado em uma incubadora padrão de cultura celular com capa d'água, e lâminas microfluídicas de duas pistas foram preparadas em um armário padrão de biossegurança para carregamento. A viabilidade e a morfologia da cultura PDX microfluídica 3D foram avaliadas em condições separadas de centrifugação de centrífugas não paraxidas e gradientes de densidade. No primeiro dia, as culturas submetidas ao método de separação apresentaram dez vezes menos células mortas em comparação com culturas não paradas.
É importante ressaltar que os aglomerados separados consistiam principalmente de células vivas. Não foi identificada diferença estatisticamente significativa para a distribuição do tamanho do cluster. As culturas foram mantidas na placa microfluida por sete dias.
O número total de células vivas permaneceu consistente, e os clusters mantiveram aproximadamente 80% de viabilidade ao longo da vida da cultura. Lembre-se que cada linha PDX é única, de modo que a facilidade de digestão do tumor, o tamanho fenotípico e a morfologia dos clusters, e a localização do cluster dentro da purificação do gradiente variam. As culturas PDX estabelecidas usando este método podem ser avaliadas com ensaios de viabilidade baseados em imagem ou leitor de placas, rotulados fixos e imunofluorescentamente, ou dissociados para coletar lises celulares para outros protocolos.
O método permitirá que os pesquisadores recapitulem o microambiente tumoral, a fim de explorar a biologia ou a resposta medicamentosa das células tumorais. Os usuários devem completar o treinamento padrão de indivíduos humanos e o treinamento de patógenos transmitidos pelo sangue antes de trabalhar com tecidos derivados do homem. Equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados.
