Nós aqui fornecemos um protocolo detalhado para avaliar as propriedades gratificantes ou aversivas da estimulação genética de uma região cerebral específica. A técnica pode responder rapidamente se a estimulação de células específicas é gratificante ou aversiva. Descrevemos a configuração para estimular a área tegmental ventral, mas nossos protocolos podem ser facilmente adaptados para alterar parâmetros específicos em termos de diferentes regiões estudadas.
Para começar, use microcontroladores de placa única para controlar a fonte de laser. Carregue o script na placa de microcontrolador usando o cabo de conexão apropriado para o computador. O script inclui modulação externa proveniente do software de rastreamento através de uma caixa TTL, e uma saída para o laser para controlar parâmetros de estimulação.
Use um cabo de rede para conectar a caixa TTL à placa. Certifique-se de que o laser está configurado para controlar por modulação externa e conecte o laser à placa usando um cabo FC/PC. Conecte os pinos apropriados às partes do solo da placa.
Para conectar a fonte laser à fibra óptica, primeiro conecte a fonte de laser a uma junta rotativa. Conecte um cabo de remendo à junta rotativa. Estabilize a junta rotativa acima do aparelho, mas fora da área de gravação.
Certifique-se de que o comprimento do cabo de remendo de fibra óptica é apropriado para permitir que o mouse se mova sem dificuldades na arena. Para calibrar a configuração da arena, use uma régua para medir uma parte específica do aparelho físico. No software, desenhe uma linha correspondente à peça medida.
Na escala Desarmes para Calibrar a guia, digite o valor já conhecido. Projete a arena, desenhe a área onde o movimento dos ratos será registrado. Crie as zonas, desenhe as zonas que eventualmente serão atribuídas como emparelhadas a laser, não-não-sem corte a laser e neutras.
Pressione o botão Validar a configuração para validar a configuração para confirmar se não há parâmetros conflitantes, por exemplo, zonas fora da arena. Certifique-se de que o controle de hardware está ativado e defina o tempo do experimento para 30 minutos, para a opção repetir até as configurações da caixa de referência. Atribua um compartimento como emparelhado a laser, no qual a entrada do mouse acionará um sinal TTL através do software de rastreamento para a placa de microcontrolador sob as configurações da condição.
Para modificar a configuração para a abordagem de preferência do compartimento neutro, após a configuração da arena e do tempo, atribua as zonas A e B como emparelhadas a laser adicionando quando o ponto central estiver em qualquer zona A e zona B para a caixa de condição relacionada às configurações dos compartimentos A e B. Para configurar as configurações de detecção, use um boneco para se assemelhar ao mouse. Coloque o boneco em um compartimento do aparelho e use a configuração automatizada com subtração dinâmica.
Remova o boneco e coloque-o no compartimento oposto. Certifique-se de que o boneco está totalmente detectado. Coloque o boneco no compartimento emparelhado com laser.
Para verificar se a estimulação funciona, comece a aquisição usando as configurações de controle de ensaio configuradas anteriormente e veja se a estimulação é acionada como deveria. Em seguida, coloque o boneco no compartimento não pago ou neutro, e veja se a estimulação está parada. Use o botão no laser para definir a potência laser para 10 miliwatts.
Conecte o implante de fibra óptica ao cabo de remendo de fibra óptica usando uma manga cerâmica e coloque o mouse no compartimento neutro do aparelho de três compartimentos. Aguarde até que o mouse seja detectado pelo software. Remova as portas de correr vertical que impedem o animal de entrar nos compartimentos principais.
Permita que o animal explore livremente sem distúrbios. Todo o experimento de preferência do lugar em tempo real ocorre ao longo de oito sessões. Os camundongos DAT-Cre injetados com o vírus EYFP de canal de AAV na área tegmental ventral foram testados para atingir neurônios dopaminérgicos.
Os camundongos passaram em média cerca de 70% do seu tempo no compartimento emparelhado a laser, em oposição ao compartimento não pago a 20% e ao compartimento neutro em 10%Um fenótipo comportamental oposto foi observado com ratos Vglut2-Cre injetados com EYFP canal de canal de AAV na área tegmental ventral. Os ratos evitaram o compartimento emparelhado com a estimulação, e passaram mais tempo no não pago. Durante as respostas condicionadas dias cinco e oito, os ratos não mostraram uma clara evitação do compartimento anteriormente emparelhado.
Para demonstrar ainda mais o papel gratificante ou aversivo dos neurônios específicos, o método descrito pode ser elogiado com outros métodos, como paradigmas operon, ou subestimulação fotogenética. Preste atenção durante o manuseio de vírus e quando você usa fontes de laser.
