O protocolo atual contribui para o estudo dos mecanismos cerebrais subjacentes ao comportamento motor qualificado. A optogenética sem fio permite a manipulação de neurônios específicos enquanto os sujeitos realizam uma tarefa em livre circulação. Em combinação com a videografia de alta velocidade, é possível ter uma análise detalhada do comportamento motor fino.
O método poderia ajudar a entender problemas motores em distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos. Essas técnicas também podem ser usadas para estudar a função cerebral em outros paradigmas comportamentais. Diana Rodriguez-Munoz, uma estudante de graduação do meu laboratório, estará ajudando com a experiência.
Para os procedimentos cirúrgicos, comece pela preparação de uma cânula led do comprimento desejado de acordo com as coordenadas dorso-ventral da estrutura de interesse. Para isso, corte a fibra de vidro em um comprimento maior do que o tamanho final desejado e triture a ponta de fibra até o comprimento do alvo com lixa áspera. Em seguida, polir a ponta de fibra com lixa fina.
Para microinjeções, encha uma pipeta com o óleo mineral e coloque a pipeta no microinjetor. Certifique-se de que o microinjetor funcione corretamente injetando um pouco de óleo mineral. Em seguida, prepare o rato anestesiado para a cirurgia aplicando uma pomada oftálmica e removendo o cabelo do couro cabeludo com um aparador e creme de depilação.
Em seguida, limpe o couro cabeludo com cotonetes com 8% de iodo povidone e 70% de etanol alternado três vezes cada. Após a higienização, coloque o mouse no aparelho estereotaxico e fixe a cabeça, garantindo que o crânio seja nivelado nos eixos medial-lateral e anterior-posterior. Use um bisturi para fazer uma incisão de um centímetro através do couro cabeludo ao nível dos olhos ao longo do eixo sagital.
Em seguida, retraia a pele para expor o crânio e limpar o periósteo com cotonetes de algodão. Limpe a superfície do crânio com solução salina e cotonetes de algodão e resolva qualquer sangramento na superfície usando lanças oculares absorventes estéreis. Em seguida, aplique uma gota de 2,5% de peróxido de hidrogênio com um cotonete e deixe agir por alguns segundos para tornar as suturas do crânio visíveis e ter uma referência melhor.
Depois de alguns segundos, limpe bem a área com um cotonete limpo. Com uma pipeta de vidro de 15 mícrons de diâmetro final, localize bregma e lambda para verificar se o crânio está nivelado no eixo anterior-posterior. Em seguida, pinte um ponto de referência no couro cabeludo acima das coordenadas selecionadas com um marcador.
No ponto de referência, realize uma craniotomia de um milímetro de diâmetro aplicando pressão suave no crânio com uma ferramenta rotativa a uma velocidade de baixa a média velocidade com uma broca dentária pequena e redonda. Uma vez feito, mova o capilar em direção às coordenadas anterior-posteriores selecionadas, ou AP, e medial-lateral, ou ML. Carregue o capilar com 300 a 400 nanoliters do vírus adenoassociado ao CreE, ou AAV, como AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry para expressar canalrhodopsina na região de interesse.
Um AAV pode ser usado como controle para expressar a proteína do repórter. Depois de garantir que a ponta não esteja entupida, introduza a pipeta de vidro no cérebro no dorso-ventral menos 3,35 milímetros no estriado lateral dorsal e injete 200 nanolitres do vírus usando um injetor automático a uma taxa de 23 nanoliters por segundo. Aguarde 10 minutos após a injeção antes de retirar a pipeta de vidro lentamente para evitar derramamento.
Em seguida, limpe e seque qualquer resíduo com cotonetes de algodão. Em seguida, conecte a cânula led de vidro ao braço estereotaxic e calibrar as coordenadas usando bregma como referência. Em seguida, insira a cânula lentamente para evitar danos teciduais e coloque-a 100 micrômetros acima do local da injeção.
Uma vez que a cânula led esteja no lugar, adicione uma gota de 100 microliters de adesivo de tecido na borda da craniotomia. Use uma escova estéril para aplicar uma mistura de cimento dentário recém-preparada ao redor do conector da cânula pouco a pouco, construindo camadas até que o crânio esteja coberto e o conector esteja bem preso ao crânio, deixando os pinos completamente livres. Quando o cimento seica completamente, feche a pele ao redor do implante usando adesivo de tecido.
Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola de recuperação sobre uma almofada de aquecimento a 33 graus Celsius enquanto monitora os sinais de desconforto ou dor. Regisso o comportamento do animal com uma câmera regular e capture de 30 a 60 quadros por segundo da frente da câmara. Um espelho pode ser colocado sob a câmara de treinamento em um ângulo de 45 graus para monitorar a postura do animal.
Quando os ratos começarem a atingir a pelota, gire a cânula LED manualmente com o controlador remoto para ter uma estimulação contínua durante o tempo em que o comportamento for realizado por não mais do que dois segundos. O dispositivo de estimulação aciona um LED de 470 nanômetros com intensidade na ponta de um milímetro por milímetro quadrado. O bom comportamento motor do animal sob manipulações optogenéticas foi estudado com a tarefa de alcançar a compreensão.
Os ratos aprenderam a executar a tarefa em alguns dias e alcançaram mais de 55% de precisão, atingindo um patamar após cinco dias de treinamento. A trajetória dos movimentos foi acompanhada com videografia de alta velocidade, possibilitando a análise da cinemática. Foi realizada a avaliação quantificável de parâmetros como distância percorrida, velocidade, aceleração, ponto final e trajetória.
Nos ensaios perdidos, os ratos começaram o movimento de agarramento mais longe da pelota do que os testes de sucesso. Além disso, os erros foram significativamente associados à postura do mouse, demonstrada por diferenças no ângulo do corpo durante os ensaios de batida e falta. A ativação contralateral da dopamina D1 expressando neurônios de projeção espinhosos, ou SPNs, reduziu o sucesso de agarramento em comparação com as condições de controle.
Durante uma estimulação optogenética, a trajetória da pata aumentou na distância de viagem, levando à incapacidade de atingir a pelota e a um aumento no erro inicial tipo um. A análise dos componentes de princípio, ou PCA, mostrou que todas as trajetórias de ensaios durante a ativação de SPNs D1 contralateral se separaram em um cluster quase sem sobreposição com o cluster de controle, indicando baixa similaridade. A ativação das DSPNs no lado ipsilateral levou a um aumento na dispersão de trajetória demonstrada pela análise do PCA.
Assim, a ativação ipsilateral D1 SPNs modificou a trajetória de alcance sem alterar o desfecho comportamental. Ao executar este protocolo, tenha cuidado para colocar a cânula corretamente para que ela não se desprende durante as sessões de treinamento. Esse método pode ser usado em outros paradigmas comportamentais para estudar comportamento motor, processamento sensorial, aprendizagem e memória.
A optogenética sem fio permitirá estudar o comportamento naturalista e seus fundamentos neurobiológicos em assuntos verdadeiramente em movimento livre.
