These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

! ATENÇÃO: Este protocolo envolve o uso de lasers da classe 3B e exigirá diretrizes de treinamento e segurança adequados a serem seguidos. Óculos de segurança deve ser usado em todos os momentos ao operar lasers, com procedimentos de alinhamento apresentando um risco particularmente elevado. Contactar o fornecedor de laser para determinar os óculos que irão proporcionar a atenuação máxima para um dado laser. Se estiver disponível, se inscrever em um curso de treinamento de segurança a laser institucional. Nunca utilize um laser sem o óculos de segurança e treinamento adequados. 1. Laser Aparelho Set-up Se for caso disso, os passos na secção 1 são designados como (A) ou (B) para diferenciar entre os sistemas de laser simples ou dupla, respectivamente. <ol><li> Anexar e garantir lasers à placa de ensaio. Breadboards são excelentes condutores de calor e agir como um dissipador de calor para evitar danos aos componentes internos do laser com o uso prolongado. </li><li> (A) Fixar a pré-las acopladoer a um 10 &quot;x 12&quot; placa de ensaio (ou como necessário) usando ¼-20 &quot;parafusos de fixação e as anilhas (Figura 2A). Se os furos breadboard não se alinham com os furos de montagem do laser, usar pequenas &#39;grampos de mesa&#39; para garantir a laser para breadboard. </li><li> (B) Se os dois lasers a utilizar têm muito diferentes alturas do feixe (&gt; ~ 1 cm), use pequenas 4 &quot;x 6&quot; breadboards para criar uma plataforma para um dos lasers. Anexar estas placas para as principais grandes 12 &quot;x 18&quot; placa de ensaio usando ¼-20 &quot;parafusos de fixação com arruelas, em seguida, anexar o laser para as placas menores usando parafusos de fixação ou grampos de mesa, como mostrado na Figura 2B. Fixe o outro laser diretamente à placa de ensaio usando parafusos de fixação ou uma variável grampo de mesa altura. Passo Crítica: Breadboards, parafusos e componentes ópticos podem ser adquiridos como imperial ou métrica que assim seja consistente na compra de itens; o padrão para este protocolo é imperial. </li><li> (A)Anexar uma espessura de jaqueta-se apegam flat / contato físico (FC / PC) patch cord ao acoplador (referido como um cabo de engate; veja a Figura 3) que está fisicamente conectado à frente do laser (Figura 2A). </li><li> (B) Passe o acoplador para um ¾ &quot;post óptica, então epóxi a articulação entre o acoplador e o topo do poste usando JB Kwik, ou epóxi semelhante, para evitar o afrouxamento e desalinhamento durante o uso. Fixe o correio para o placa de ensaio (como os buracos breadboard nem sempre se alinham com a colocação necessária de componentes ópticos, um investigador, adaptador de base de pedestal, e aperto garfo são usadas para proteger pós óptica do acoplador no lugar). Conecte um cabo de manobra de espessura de jaqueta (cabo de acoplador) para a parte de trás do engate. </li><li> (B) Insira o primeiro espelho de orientação para o laser azul no suporte cinemática, e anexá-lo à placa de ensaio usando um ¾ &quot;post óptica. Fixe este post para uma base de adapTer e fixação do garfo. Posicione o garfo de fixação e montagem postar diretamente na frente do laser azul com espelho inclinado a 45 ° para dirigir o laser em direção ao espelho dicróico. Use o padrão de grade de furos na placa de ensaio como um guia de alinhamento áspera. Uma vez que aproximadamente posicionado, use um parafuso ¼ &quot;-20 tampa para proteger o garfo de fixação à placa de ensaio (ver Figuras 2B, C). </li><li> (B) Insira o espelho dicróico em um suporte de cinemática e anexá-lo a um &quot;post óptica 1 e garantir diretamente à placa de ensaio. Posicione o espelho dicróico para a extrema esquerda de, e de acordo com, o espelho de laser azul. Ângulo do espelho dicróico em um ângulo de 45 ° de tal modo que a luz azul refletida fora do primeiro espelho é refletido no acoplador, em seguida, aperte o parafuso de fixação do titular cinemático para o cargo (ver Figuras 2B, C). </li><li> (B) Fixe o primeiro espelho de direção para o laser amarelo a um ¾ &quot;post óptica. Fixe o optical post para um adaptador de base e de fixação do garfo. Posicione o garfo de fixação e de pós-conjunto em frente do laser amarelo e ângulo do espelho em um ângulo de 45 ° tal que a luz amarela será direcionada para o segundo espelho de direção. Prenda o garfo de aperto no lugar com um ¼ &quot;-20 parafuso e uma arruela. </li><li> (B) Fixe o segundo espelho de direção para o laser amarelo a um &quot;post óptica 1. Ângulo do espelho de modo a que o feixe de luz amarela a partir do primeiro espelho irá ser reflectida através da dicróico e no acoplador (Figura 2C). Prenda o pós diretamente ao placa de ensaio e aperte o parafuso de montagem uma vez que o espelho é inclinado de forma adequada. Ajustes espelho Belas será feita usando as montagens espelho cinemáticas em uma etapa posterior. </li><li> (B) Anexar uma roda de filtro de densidade neutra para uma ¾ &quot;post óptica e colocar o cargo em um suporte pós ligado a uma base de montagem. Fixe o conjunto da placa de ensaio entre o primeiro e seespelhos amarelo cond usando um único ¼ &quot;-20 parafuso. Esta roda é usada para ajustar a energia de luz laser amarelo atingindo o acoplador. Dica: Individualmente aperte todos os componentes (como os parafusos que prendem os titulares espelho cinemáticas para o início de posts, e os fios que prendem adaptadores de base para o fundo de posts) antes de anexá-los à base. Use um veio de uma pequena chave sextavada nos fornecido através de-buracos em postos ópticos para obter torque suficiente. Isso vai evitar que os componentes se soltar durante o uso, necessitando de realinhamento. </li><li> Anexar um FC / PC para PC / adaptador de suporte em L FC para a placa de ensaio. </li><li> Opcional: Garantir um 1 x 2 50/50 mini-fibra cubo divisor directamente para a placa de ensaio para utilização simultânea estimulação in vivo de dois ou mais animais. Além disso, os cabos podem ser adicionadas para facilitar o movimento do conjunto de placa de ensaio (como visto na Figura 2A). </li></ol> 2. Laser Coupling (sem contato Estilo Coupling) Esta seção refere-se a dupla laser-set-up (Figura 2B). Alinhe o caminho laser azul interior antes de alinhar o caminho laser amarelo exterior. ! CUIDADO: Use um baixo consumo de energia de acoplamento da luz (~ 1 mW) para garantir a segurança dos olhos. Use óculos de segurança para ligar o laser e até a intensidade da luz é medida e considerados seguros. <ol><li> Definir os interruptores na parte de trás do laser para &quot;Curr&quot; (corrente) e modo de transístor-transístor lógica (TTL) + para a iluminação constante (como oposto para o modo analógico). Certifique-se de que o botão de energia na frente do condutor é fixado em zero. Ligue o laser ligando o piloto de primeira e, em seguida, a tecla de laser. </li><li> Ajuste lentamente o botão de alimentação localizado na parte frontal do controlador de laser para que ~ 1 mW luz laser está sendo emitida. Aguarde 10 - 15 minutos (ou conforme especificado pelo fabricante) para o laser para aquecer. </li><li> Conecte o cabo de fibra óptica testador diretamente para a free final do patch cord acoplador e ligue o testador de cabo (Figura 3A). Ajustar o ângulo do acoplador, de modo que o feixe de vermelho viaja em linha reta de volta em direcção ao centro do espelho dicróico. O caminho do feixe de luz vermelha emitida a partir do testador de cabo é o caminho exacto que a luz do laser de entrada precisará seguir a fim de ser acoplado para o laser. </li><li> Faça o alinhamento grosseiro: Use os botões laterais e horizontais nos espelhos cinemáticas para dirigir o feixe de luz do laser para o acoplador. As braçadeiras de pedestal pode precisar de ser ligeiramente afrouxado para reposicionar os espelhos e o acoplador. As montagens cinemáticas ainda deve ter algumas viagens disponíveis para mais ajustes finos. Não se preocupe se não houver luz azul está sendo emitida fora do patch cord anexado-acoplador neste momento. </li><li> Coloque um único pedaço de papel semi-translúcido diretamente na frente do espelho dicróico, entre o dicróicas e acoplador. Haverá tanto um azul e ared ponto neste papel do laser e do testador de cabo, respectivamente. Utilize papel que é translúcido o suficiente para ver tanto os pontos vermelhos e azuis simultaneamente a partir do mesmo lado do papel. </li><li> Faça ajustes finos para o primeiro espelho da direcção (ou seja, aquele mais próximo do laser, não o dicróicas), ajustando cuidadosamente os botões laterais e horizontais para alinhar o centro do ponto vermelho com o ponto azul. </li><li> Mover o papel para trás para o acoplador de modo a que seja directamente em frente do acoplador e ajustar os botões no segundo (isto é, dicróico) espelho para alinhar o feixe de laser com o feixe de vermelho. </li><li> Iterar os passos 2.6 e 2.7 até que o centro das vigas azul / amarelo e vermelho são exactamente alinhadas em ambas as posições (isto é, até que os feixes vermelhos e azuis são colineares). </li><li> Retirar o testador cabo do cabo do acoplador. A luz do laser deve agora ser emitida a partir da extremidade do cabo de remendo acoplador. </li><li> Determine eficiência de acoplamento através da medição da energia de luz emitida a partir da ponta da fibra do acoplador de cabo de remendo usando um medidor de potência. Use a configuração de 500 mW em fotodiodo do medidor de energia e alterar a configuração de (λ) de comprimento de onda para o azul (473 nm) ou luz amarela (635 nm) espectro dependendo o laser a ser utilizado. </li><li> Colocar a ponta da fibra perpendicular ao fotodiodo para obter uma leitura de potência. Comparar a energia de luz que entra no acoplador, para a energia de luz emitida a partir da extremidade da fibra. A eficiência de acoplamento de&gt; 80% é considerado muito bom. Muito pequenos ajustes na segunda espelho de orientação às vezes pode melhorar um pouco acoplamento. Em geral, quando o padrão de feixe a partir da extremidade da fibra de ligação é apertado um pequeno ponto central (sem anéis que o rodeiam), a eficiência de acoplamento para dentro do núcleo da fibra é óptima. </li><li> Repita os passos 2,1-2,11 para acoplamento laser amarelo, exceto usar os dois espelhos de direção para o laser amarelo (veja a Figura 2C). Será que nãot ajustar a posição do espelho dicróico ou alinhamento do laser azul será perdido. </li></ol> 3. Estimulação in vivo Optogenetic Certifique-se de que quaisquer procedimentos que envolvam o uso de animais são conduzidos de acordo com as diretrizes locais e nacionais e aprovado pelo correspondente Institutional Animal Care e do Comitê Use. <ol><li> Fibra óptica set-up (ver Figura 3B para a identificação dos diferentes tipos de cabos de remendo referido abaixo). Para estimular um único mouse, conecte o cabo de manobra de acoplamento a um cabo de correção de espessura de jaqueta usando o / FC adaptador de suporte em L FC diretamente ligado à placa de ensaio (ver Figura 4A). Para estimular a dois animais de um laser, conecte o cabo de manobra de acoplamento para dois cordões grossos de jaqueta usando o 1 x 2 50/50 mini-cubo (veja a Figura 4B). Para estimular a três ou mais animais, conecte o cabo de acoplador para um divisor de fibra multimodo usando o 1 x 2 mcube ini já anexado à placa de ensaio (ver Figura 4C). </li><li> Anexar um comutador / junta rotativa para as extremidades livres do splitter remendo cabo / fibra de espessura de jaqueta. Comutadores são essenciais, pois permitem a rotação da fibra com o movimento do roedor, o que impede o acúmulo de torque no cabo de manobra. Demasiada binário pode torcer cabos de, levar à ruptura, e interferir com o movimento natural do animal durante o ensaio. </li><li> Conecte o cabo de remendo animal para o comutador. </li><li> Anexar uma manga de divisão de ligação para o final de metal ponteira livre do cabo de remendo do animal (Figura 5). Não force a manga de todo o caminho até a ponteira; deixar ~ 0,5 cm da manga exposto como este é o que se conecta à fibra óptica implantado afixada ao animal (Figura 6). Passo Crítica: Sempre comprar mangas que contêm uma divisão para permitir a expansão da manga sobre ponteira de fibra implantado durante a ligação eremoção. Muito apertado de um ajuste pode causar trauma grave para o animal se o implante desaloja a partir do crânio ao tentar desconectar a manga do implante. Se isto não ocorrer, o animal deve ser retirado do estudo e recebem cuidados veterinário imediato. Da mesma forma, antes de usar um novo manga, pela primeira vez, &quot;quebrá-lo em &#39;por ligar e desligar um ferrolho até ele desconecta com a quantidade desejada de força. Tip: É fácil de quebrar uma fibra durante a remoção de uma manga que é rigidamente ligada a um ferrolho. Para evitar isso, empurrar o ferrolho para fora através da inserção de uma pequena haste de madeira dentro da extremidade aberta da manga (o identificador de um cotonete padrão é o tamanho correctos). </li><li> Conecte o condutor de laser azul para um gerador de pulsos, utilizando um cabo BNC e vire o gerador de impulsos diante. </li><li> Coloque óculos de segurança apropriadas diante. Definir os interruptores na parte de trás do laser para o modo &quot;Curr&quot; e &quot;TTL +&quot;. Certifique-se de that o botão de energia na frente do condutor é fixada em zero andturn o laser (transformar o motorista em primeiro lugar e, em seguida, a tecla de laser). </li><li> Ajuste o botão de energia na parte frontal do laser de modo a que 5 - 10 mW está a ser emitida a partir da ponta da fibra patch cord animal, tal como medido usando um medidor de energia da luz. 5 - 10 mW é uma orientação geral - a intensidade de potência exacta requerida para afectar um dado volume de tecido deve ser calculada antes do início da experiência, tal como no Aravanis 3 et al. </li><li> Desligue o laser azul para o modo &quot;Analog&quot; in vivo para estimulação. Nota: lasers DPSS amarelas são operados em TTL + modo de iluminação constante. Aguarde 10-15 min para o laser para aquecer. </li><li> Gentilmente restringir o mouse e conecte a manga de divisão no patch cord animal para a fibra implantável crônica (ver Figura 6). Certifique-se as extremidades das duas fibras fazer contato físico com o outro. Use a divisão na manga de ligação como umjanela para visualizar o contato direto entre os dois Passo Crítica:. Às vezes, os restos podem acumular-se na ponteira de metal de fibra implantável do animal e interferir com a conexão adequada. Neste caso, use um etanol limpar para limpar suavemente a ponteira sobre a cabeça do animal antes da fixação. Nunca force uma manga de ligação por cima da ponteira pois isso pode causar trauma grave para o animal. Se uma conexão física entre extremidades da fibra não pode ser feita após a limpeza, remover o animal do estudo. Dica: o vazamento de luz pode ocorrer no ponto de conexão entre a fibra e animal patch cord implantado. Visualization dessa luz por roedores pode apresentar uma confundem experimental 10. Calor psiquiatra tubulação pode ser anexado ao patch cords e deslizou sobre o ponto de conexão para minimizar a luz parasita. </li><li> Permitir que o rato para recuperar durante alguns minutos antes do início do teste de comportamento. Dica: Depending no teste comportamental a ser administrada, é melhor se que se habituem ratos para o processo de ligação e amarrar 2 - 3 dias antes, como a manipulação necessária para ligar o animal pode induzir stress e confundir os ensaios de comportamento. </li><li> Posicione o mouse no aparelho de testes comportamentais garantindo que o cabo do conector está livre de dificuldades. Nunca deixe um animal sem vigilância durante a estimulação. Mesmo com a utilização de comutadores, cordões têm tendência a torcer durante períodos de tempo prolongados e podem interferir com os ensaios de comportamento. </li><li> Use um gerador de pulso a pulso do laser azul com uma frequência pré-determinada que ativará opsina de escolha. Para o uso do laser amarelo: pulsar o laser amarelo com persianas externas ou simplesmente bloqueando o caminho do feixe com um não-reflexivo objeto opaco, e não inflamável. </li></ol> 4. Pós in vivo Considerações Estimulação Esta secção não se destina a ser um proto completacol, mas é oferecido como orientação para procedimentos adicionais que devem ser considerados seguinte in vivo estimulação optogenetic. <ol><li> Após a conclusão de um experimento, confirmar viral e fibra histologicamente colocação para a interpretação precisa dos resultados comportamentais. Eutanásia dos animais de acordo com as orientações institucionais e perfundir o animal com solução salina gelada tamponada com fosfato (PBS) e 4% (w / v) de paraformaldeído em PBS. </li><li> Remover implantado fibra óptica, segurando firmemente a ponteira de metal exposto com um alicate ou hemostats. Suba em um liso, ainda rápido, movimento. É importante para testar a integridade da fibra implantado medindo a emissão de luz no final de cada experiência. </li><li> Post-fixar os cérebros em paraformaldeído por pelo menos 24-48 horas antes do corte através da região de interesse. (Se estiver usando um micrótomo de congelação, incubar cérebros em uma solução de sacarose 30% durante vários dias antes do corte). Execute imunohistoquímica usando standard protocolos para a detecção dos fluorophores marcado com opsina adequadas, ou seja, a proteína verde fluorescente (GFP), o reforço da proteína fluorescente amarela (EYFP) ou mCherry. </li><li> Consulte o site de expressão opsina e implante de fibra sob um microscópio e visualmente confirmar o posicionamento adequado de injeção de vírus e implante com base em coordenadas escolhidas. </li></ol>

<ol>
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The authors have no conflicts of interest to report.

As estratégias atuais amarrar a laser descrita set-ups e são compatíveis com uma ampla gama de testes comportamentais de roedores. Na verdade, uma variedade de testes comportamentais têm sido utilizados seguinte, ou que o acompanha, in vivo estimulação optogenetic que incluem tarefas emotivos comportamentais, condicionamento comportamental, aprendendo e paradigmas de memória, sono, excitação e tarefas apetitivas para citar alguns (ver Nieh et al. 6 para uma revisão abrangente). Optogenética mudou a forma como testes comportamentais tradicionais são conduzidas em que os estudos de vários dias já pode ser condensada em uma única sessão em que o comportamento é comparado, dentro-sujeitos, durante épocas distintas de luz &#39;on&#39; versus &#39;off&#39; 5. De nota, aparatos comportamentais que contêm portas, fechadas compartimentos ou outros obstáculos podem ter que ser modificado para acomodar a passagem de fibras amarrados. O descrito estratégias amarrar autorização siestimulação multaneous de ratinhos múltipla a partir de um único laser. Alta capacidade optogenetic teste comportamental pode, por conseguinte, ser conseguida através da utilização de vários lasers e equipamento de teste. O número de animais que podem ser estimulados simultaneamente, no entanto, vai ser limitada pelo poder de luz máxima que pode ser conseguida em cada ponta da fibra. Potência máxima de saída na ponta da fibra depende da 1) de alimentação a partir do laser; 2) eficiência de acoplamento e 3) o número de divisões de feixes. Para um laser de 100 mW azul com ~ 80% de eficiência de acoplamento e até 4 divisões de feixes (como representado na Figura 4C), potência média na ponta da fibra pode variar entre 5-10 mW quando usando 200 um núcleo, 0,22 NA patch cords de fibra (nb de esperar a perda de transmissão de juntas rotativas para ser &lt;15%). Medir a saída de luz na ponta da fibra é essencial para determinar o poder de luz adequada para a ativação opsina como opsinas diferem na sua sensibilidade à luz e, portanto, a densidade de potência de luz (mW/ Mm 2) necessária para a activação 11. Por exemplo, a opsina estável função-passo (SSFO) atua como um acumulador de fótons e, portanto, requer muito pouca densidade de potência de luz para ativação (&lt;8 mW / mm 2) 8. Compare isso com o canal tradicional rodopsina (ChR2) que requer um mínimo de 1 mW / mm 2 de luz para provocar potenciais de ação 2. Tabela 1 é fornecido como uma referência rápida para conhecidos irradiancias mínimos luz necessária para ativar as opsinas mais comuns atualmente em usar. Por último, é preciso considerar que espalha luz e absorve enquanto viaja através do tecido cerebral de tal forma que mais energia de luz é necessário para estruturas mais profundas do cérebro 3. Um recurso útil está disponível em linha em <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> que vai calcular a intensidade de luz em várias profundidades através dos tecidos cerebrais, tendo emconta a dimensão do núcleo da fibra, abertura numérica, comprimento de onda da luz utilizada, e o poder de luz a partir da ponta da fibra. Para uma excelente visão geral dos princípios teóricos subjacentes a estes cálculos, consulte Foutz et al. (2012) 12. Exemplos de como aplicar esses princípios e cálculos ao delineamento experimental, são demonstrados em Aravanis et al. (2007) 3 e Tye et al. (2012) 13. Realizando esses cálculos antes do início de um experimento é crucial para garantir irradiância luz adequada para a ativação opsina. Dadas estas considerações, é vantajoso para comprar lasers de alta potência para garantir potência adequada. Lasers com uma potência entre 100-200 mW são geralmente suficientes para compensar pequenas fibras de núcleo, divisão de fibra múltipla, acoplamento de ineficiência e transmissão perde 7. Se estiver usando lasers de alta potência, no entanto, deve-se tomar cuidado para evitar danos neural ou calor e luz-associadod artefactos que podem ocorrer com iluminação de luz alimentado prolongada e / ou de alta 7. A faixa de segurança para experimentos in vivo é de até 75 mW / mm 2 14. Decidir sobre o tipo de laser a compra pode ser uma questão complicada, pois há muitos fatores a considerar. Por exemplo, lasers de diodo diretos fornecer saída pulsada mais estável e repetível do que de estado sólido (DPSS) Lasers de diodo, e são mais confiáveis ​​ao longo do tempo em um ambiente de laboratório. Em alguns casos, no entanto, os lasers de diodo directos podem emitir um menor consumo de energia de luz, ~ 0,1 mW, mesmo quando a tensão de comando é de 0 V, devido a uma polarização de corrente constante a ser enviada ao diodo pelo sistema electrónico de controlo do laser. Esta emissão &quot;espontânea&quot; tem um espectro mais amplo do que a emissão de laser a partir do mesmo laser, por isso pode ser especificamente reduzido pela instalação de um passa-banda estreita (ou &#39;limpeza&#39;) filtro entre o laser e acoplador (ver lista de peças). Este filtro tambémreduzir a produção de energia por ~ 50% quando lasing, então comprar um laser de alta potência em conformidade. Deve notar-se que os lasers DPSS amarelas são extremamente sensíveis e podem comportar-se de forma irregular e têm reduzida vida útil se rapidamente modulada por um gerador de impulsos. Ajuste de potência do laser amarelo deve ser feito através de rodas de filtros densidade externos colocados no caminho do feixe (Seção 1.7), enquanto o laser operando em modo TTL +. Como alternativa, a compra de um laser de 532 nm DPSS verde é uma alternativa de baixo custo que pode ativar halorhodopsins e archaerhodopsins. A abertura numérica (NA) de uma fibra é importante considerar ao projetar e compra de componentes de fibra para a montagem do laser set-up. O NA de uma fibra óptica determina o ângulo dos raios de luz que podem ser aceites e emitidos na ponta de uma fibra. Se uma fibra de alta NA é acoplado a uma fibra inferior-NA, perda significativa irá ocorrer nessa interface, por isso, é importante ser consistente wi<html> th fibra NA dentro de uma única configuração (ou para garantir que NA aumenta ao longo do caminho da luz). O efeito da fibra de NA no volume de tecido cerebral iluminado é menos importante, uma vez que o tecido cerebral é dispersores, e uma vez que a luz acoplada a partir de uma fonte de laser tenderá para fibras de alta-NA underfill &#39;&#39;; no entanto fibras ópticas com uma NA de 0,22 e 0,37 são comumente usados. Da mesma forma, o acoplamento de uma maior-core a uma fibra menor-core também irá resultar em perdas significativas, por isso certifique-se sempre de usar crescentes ou iguais diâmetros núcleo quando a progredir a partir da fonte de laser para o implante animal. De um modo geral, extremidades da fibra deve ser sempre tampados quando não estiver em uso para evitar a poeira e partículas build-up. É uma boa idéia para regularmente extremidades da fibra limpas e ligações (70% de álcool isopropílico funciona bem) para garantir a máxima potência de saída de luz, e para testar a potência de luz através de um &quot;implante fictício &#39;antes de começar as experiências de cada dia. &quot;&gt; Durante o teste comportamental, é imperativo que sejam tomadas medidas para controlar os efeitos da infecção viral, a expressão da proteína exógena, luz visível, e os possíveis efeitos de aquecimento dos tecidos e artefatos em comportamento animal. Portanto, o grupo controle adequado deve ser composto de animais transduzidas com um vírus de controlo (por exemplo, GFP, EYFP, mCherry) que recebem os parâmetros de estimulação luz idênticos. verificação experimental é um passo fundamental final, os dados de comportamento usados ​​para análise é inteiramente dependente da opsina e colocação adequada de fibra óptica na região de interesse . Especificamente, em animais, onde é detectado nenhum sinal imuno-histoquímica, ou se a colocação de sinal ou de fibra não é na região de interesse, em seguida, os dados de comportamento para o animal deve ser removido a partir do experimento. Além disso, é essencial para testar a saída da luz em a ponta da fibra, tanto antes implantação cirúrgica e de novo post-mortem para garantir energia luz adequada para a ativação opsina. Em animals em que tenha ocorrido a perda de luz intensa através da fibra após a experimentação (&gt; 30%) 9, os dados para que animais devem ser considerados para a remoção. Os critérios para a remoção deve ser estabelecido a priori. Por fim, deve-se considerar a freqüência de pulso necessário para modular disparo neural, o que dependerá da estrutura do cérebro e sub-tipos neuronais sendo alvejado. Existem parâmetros de estimulação de luz Optogenetic Publicado por vários sub-tipos neuronais, no entanto, a capacidade de modular disparo neural devem ser confirmadas de forma independente através in vivo ou fatia do cérebro registros eletrofisiológicos. Como uma pessoa se torna adepto com o uso de laser e modificação de laser de set-ups, as combinações de diferentes comprimentos de onda pode ser amarrado a várias fibras em um único animal ou entregues pela mesma fibra para optogenética combinatória 8. Estimulação multi-comprimento de onda vai se tornar cada vez mais importante, dado o rápido desenvolvimento da vermelho-shifted channelrhodopsins 8, a engenharia de azul-deslocada opsins hiperpolarizantes 15, o uso de biestáveis ​​opsins de função passo 8,16,17, eo crescente lista geral de opsinas com espectros de ativação distinta 11. Esta expansão da caixa de ferramentas optogenetic permitirá o controle sem precedentes de vários sub-tipos neuronais, tanto dentro como entre as regiões cerebrais para determinar seu papel no governo de estados comportamentais complexas.

Optogenética revolucionou os sistemas de nível de neurociência na busca de elementos do circuito neural condução estados comportamentais normais e pertinentes à doença. A descoberta de que opsins microbianas sensíveis à luz um poderia ser funcionalmente expressos em células de mamíferos, desde a plataforma para usar a luz para ganhar o controle sem precedentes da atividade neural com alta precisão espacial e temporal 2. Ao contrário de métodos electrofisiológicos ou farmacológicos tradicionais para a manipulação da actividade neural, Optogenetics permite o controlo de tipos específicos de células (com base na projecção genética identificar ou espacial) dentro de populações heterogéneas e em escalas de tempo fisiologicamente relevantes. A introdução posterior de uma interface neural-óptico fornecido uma ferramenta prática para a entrega de luz para comportar os animais 3. Isto permitiu para modulação em tempo real dos circuitos neuronais definidas em roedores comportando acordado, a fim de testar a causalmentepapel desses circuitos neurais na governação dos estados comportamentais relevantes para a doença neurológica e psiquiátrica 4-6. Optogenética, portanto, representa uma poderosa ferramenta para a introdução em qualquer laboratório interessado em investigar a relação funcional entre a atividade cerebral e medidas comportamentais ou fisiológicas em modelos animais. Projeto de sucesso e conclusão de um experimento optogenetic envolve várias etapas e considerações (ver Figura 1). O objetivo do protocolo atual é proporcionar aos indivíduos com as ferramentas e componentes, juntamente com o conhecimento teórico e prático, necessário para realizar a estimulação optogenetic em roedores comportando acordado. Actualmente, existem dois comprimentos de onda predominantes utilizados para activar canais de opsinas microbianas: no espectro azul (geralmente 473 nm) e os espectros de verde-amarelo (normalmente 532 ou 591 nm). Ambos os lasers e os diodos emissores de luz (LEDs) podem ser usados ​​como fontes de luz para deliver comprimentos de onda específicos da luz para o tecido cerebral. A luz não coerente emitida pelos LEDs, no entanto, faz com que a transmissão eficaz de difícil luz quando o acoplamento para as pequenas fibras básicos necessários para a estimulação in vivo roedor. Decidir sobre o conjunto do laser adequado é um passo inicial crucial e vai depender da utilização prevista para Optogenetics no laboratório. O protocolo atual descreve duas configurações básicas que diferem na sua facilidade de montagem e utilização: solteiro lasers pré-acoplado e sistemas laser duplos (ver Figura 2). Sistemas de laser individuais que são pré-acopladas pelo fabricante são, essencialmente, ready-to-go na chegada, com pouco ou nenhum set-up necessário, mas têm a desvantagem de mínima personalização do usuário final. Um sistema de laser duplo permite a entrega de dois comprimentos de onda diferentes para baixo da mesma fibra. Isto vai tornar-se cada vez mais importante com o advento de Optogenetics combinatória em que diferentes comprimentos de onda pode ser utilizado para activar / inibir Refiratipos de células T que são espacialmente co-localizado. Isto também é essencial para o uso com bi-estáveis ​​opsins função degrau onde fotocorrentes são iniciadas e terminadas pela luz azul e amarelo, respectivamente 7,8. Sistemas de laser duplo também são personalizáveis ​​como o usuário pode adicionar ou remover componentes (por exemplo, persianas externas, filtros de vara, medidores de energia em linha) a partir do caminho do feixe, conforme necessário. Devido a sua versatilidade, o duplo de laser set-up é recomendado se optogenética vai ser uma ferramenta continuou utilizada no laboratório. O acoplamento dos lasers, no entanto, pode apresentar um desafio e por isso um mecanismo de acoplamento rápido, fácil e confiável é proposto neste protocolo. Note-se, este protocolo detalha a montagem de componentes ópticos e utiliza patch cords e componentes que são otimizados para fibras multimodo passo-index com um núcleo de 200 mm e uma abertura numérica (NA) de 0,22. Tamanhos de núcleo diferentes e NA estão disponíveis para compra, no entanto todos os componentes devem, idealmente, corresponder em termos de núcleotamanho e NA, para evitar a perda de luz em pontos de conexão de fibra. Alternativamente, numa ligação de fibra, a luz pode passar a partir de um pequeno para um maior tamanho do núcleo; e / ou a partir de uma baixa para uma NA NA mais elevado de fibra sem perda adicional. Estratégias de amarrar são fornecidos para permitir que a estimulação simultânea de vários ratinhos de alto rendimento para os ensaios de comportamento. Os protocolos fornecidos pressupõem a utilização de fibras implantáveis ​​crónicas para o teste comportamental, mas pode ser modificado para protocolos de estimulação agudas. Fibras agudamente implantados são vantajosos para a combinação de estimulação optogenetic com manipulação farmacológica, uma vez que a mesma cula pode ser usada para administrar drogas e a ponta de uma fibra óptica para o mesmo local. O uso de fibras cronicamente implantados-se, no entanto, altamente recomendado para de vários dias de teste comportamental, uma vez que reduz os danos nos tecidos associados com a inserção e remoção repetidas de fibras e aumenta a precisão em termos de posicionamento consistente de fibra parailuminação tecido 3. Quando combinada com as configurações de ancoragem descritas aqui, o comportamento pode ser gravado de forma fiável através de vários dias. Meses Na verdade, a transmissão de luz de confiança foi avaliado após a implantação de fibra 9 de tal forma que a estimulação crônica e paradigmas de testes comportamentais podem, teoricamente, ser levada a cabo em vários dias e semanas. Outras informações sobre os componentes de hardware foram adicionados ao protocolo para permitir a escolha leitor o melhor produto que irá atender as suas necessidades individuais, incluindo alternativas e produtos de baixo custo que podem ser feitas em casa. Dicas importantes que são úteis durante a configuração e implementação também são fornecidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Resultados obtidos com comportamentais in vivo estimulação optogenetic são inteiramente dependentes do circuito neural a ser alvo, o modelo animal usado, e os parâmetros de modulação. Para fins de demonstração atuais, os neurônios de dopamina na área tegmental ventral, ou VTA, de tirosina-hidroxilase :: ratos Cre foram transduzidas com uma opsina estável função-passo (SSFO) 8, ou vírus de controlo (EYFP), e um implante de fibra era cronicamente implantado. A utilização de ratinhos transgénicos TH :: Cre assegura que opsina expressão está restringida às células TH + (dopamina) na ATV. A Figura 7 mostra os resultados representativos obtidos com o comportamento descrito actual do laser set-up para a estimulação simultânea de vários ratinhos. Aqui, os ratos foram estimulados com fio e ao mesmo tempo usando lasers separados (3 ratinhos / laser como na Figura 4C) e comportamento locomotora foi registada durante 1 h. Estimulação repetida dos neurónios dopaminérgicos na ATV resultou numafenótipo hiperativo que persistiu durante toda a duração da estimulação. Nenhuma mudança no comportamento locomotor foi visto em EYFP ratos (ver vídeo 1). Após teste comportamental, imuno-histoquímica foi realizada para verificar a segmentação viral preciso para VTA neurônios de dopamina e colocação de fibra foi confirmada visualmente (ver Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Figura 1. passos experimentais para in vivo estimulação optogenetic. Existem quatro passos gerais envolvidos na concepção e realização in vivo estimulação optogenetic. Este protocolo especificamente detalha os passos envolvidos na entrega de luz a partir de uma fonte de luz laser para estruturas profundas no cérebro do roedor comportar e inclui 1) a montagem do sistema de acoplamento da luz laser e; 2) as estratégias de amarração para conectar vários animais para uma fonte de luz para o teste de comportamento de alto rendimento e 3) proporciona orientações para confirmar a estratégia de direccionamento para entrega a luz - um passo que é essencial para a interpretação dos dados. Nota: apesar de o protocolo não é exclusivo de fibras implantáveis ​​crônicas para fins de amarração, recomenda-se e assumiu quando se combina a estimulação optogenetic com testes comportamentais. Ver tanto Ung &amp; Arenkiel de 2012 e 18 de Sparta et al., 2012 9 para a produção e implantação de fibras ópticas crônicas in-house. As linhas sólidas = passos abordados neste protocolo. <img alt="Figura 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Figura 2. Sistemas de laser usados ​​para estimulação in vivo optogenetic. (A) sistema de laser único para estimulação in vivo. Este laser é ph<html> ysically pré-acoplada pelo fabricante e requer pouca usuário final set-up. (B) sistema de laser duplo. Dois lasers são acoplados numa única fibra, através da utilização de espelhos que actuam para guiar cada trajecto do feixe para um estilo de engate sem contacto. Este é o mais versátil set-up como componentes ópticos podem ser removido ou adicionado como necessário, mas apresenta mais um desafio em termos de acoplamento do laser eficiente. (C) Esquema do sistema de laser duplo mostrado em (B), indicando a colocação de lasers e espelhos com o caminho do feixe de luz laser correspondente (setas) representado. Aqui, o espelho dicróico &quot;D&quot; é usado para desviar a comprimentos de onda de luz azul durante a transmissão através de comprimentos de onda amarelo para o acoplador de &quot;C&quot; e para o cabo de remendo acoplador ligado. B = laser azul; C = sem contato acoplador estilo; D = espelho dicróico; FW roda = filtro; M = Espelho; Y = laser amarelo.obter = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Figura 3. tester (A) Cabo utilizado no protocolo de acoplamento não-físico inferior:. Testador de cabo conectado diretamente a um cabo de manobra. Insert retrata ponto de conexão de cabo tester para cordas (B) de Patch referidos ao longo do protocolo do exterior para interior:.. A fibra multimodo divisor, animal patch cord preto com camisa de manga com divisão de zircônia branca anexado ao-se apegam plano final (FC), cabo de remendo com camisa de espessura (também referido como um &quot;cabo do acoplador&quot;). Patch cords grossas de jaqueta são revestidas com policloreto de vinila (PVC) tubos para proteção extra. Para esses cabos, códigos de cores padrão da indústria são utilizados para distinguir entre diferentes tipos de fibra, onde laranja = fibra multimodo. Patch cords animal são<html> mais fino revestido para permitir flexibilidade para o movimento dos animais durante o teste comportamental. Note-se que a poeira tampas são colocados no FC / PC termina quando os cabos não estão em uso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Figura 4. As estratégias de tethering para in vivo estimulação optogenetic de (A) um único animal, (B) dois animais; . (C) três ou quatro animais configurações possíveis não se limitam àquelas mostradas acima - várias configurações são possíveis através da combinação única de adaptadores, divisores de fibra e de ramificação patch cords que estão disponíveis comercialmente ou por ordem feita sob encomenda. Nota: patch cords e divisores de fibra conter FC conectores / PC em ambas as extremidades (apenas um final é retratado).&quot;target =&quot; _ ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Figura 5. Conexão corretas e incorretas (vermelho x) de um cabo de manobra para uma fibra óptica implantável usando uma luva de divisão. (Painel esquerdo) A zircônia split-manga é utilizada para ligar um cabo de manobra para a ponteira de uma fibra óptica implantável (mostrado aqui não aposta em um animal). Seta está apontando para o ponto de conexão entre o cabo de remendo e implantável de fibra óptica. Compare com (painel direito), onde existe uma lacuna entre o patch cord e implantável de fibra óptica, como visualizado através da divisão da manga de ligação. Observe o vazamento de luz que pode ocorrer com uma conexão deficiente (canto inferior direito). Inserção inferior em upper painel esquerdo descreve componentes individuais utilizados. De cima para baixo de inserção: cânula de fibra óptica implantável dórico, branco zircônia split-manga,-cleeve plana (FC) final de um patch cord animal branco de jaqueta (patch cord completo apresentado na Figura 3B). Em todos os painéis, note que a manga de conexão não esteja alinhada com o FC extremidade do cabo de patch. Deixar ~ 0,5 centímetros de um excesso de cair para a ligação à fibra óptica implantável aposta no animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Figura 6. lateral (esquerda) e vista frontal (direita) de um rato com uma fibra óptica implantada conectado a um cabo de manobra. Use a divisão na manga de ligação para ajudar a visualizar a conexão apropriada do patch cord to ferrolho da fibra óptica implantado. O ponto de conexão é destacado por uma caixa tracejado vermelho e também representado na inserção superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Figura 7. Os resultados representativos. (Esquerda) leitura comportamental de in vivo estimulação optogenetic. Exemplo de comportamento que podem ser obtidos utilizando o laser descrita set-up e protocolo de tethering. A actividade locomotora foi registada durante a estimulação optogenetic de área tegmental ventral (VTA) em tirosina-hidroxilase (TH) :: ratinhos Cre (n = 7-8 / grupo) ou transduzidas com um opsina funções-degrau (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) ou vírus de controlo (AAV5-DIO-EYFP) na VTA. Grupos de três ratos foram simultaneamente ligado a uma únicado laser, como representado na Figura 4C e estimuladas com um pulso de 5 s 447 ou 473 nm de luz entregue, após cada 15 min. Two-way ANOVA medidas repetidas revelou uma interação grupo significativo x tempo (F 3,39 = 15,27, p &lt;0,0001) e um efeito principal de tempo significativo (F 3,39 = 4,67, p = 0,007), pelo que a estimulação optogenetic aumento da atividade locomotora apenas em ratinhos SSFO (Bonferroni post-hoc de p &lt;0,0001, em relação ao t = 0 - 15 horas bin) resultando num aumento global na actividade locomotora em comparação com ratinhos EYFP (efeito principal do grupo de: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc de p &lt;0,01 em t = de 15 - 30 e p &lt;0,001, em t = 30 - 45 e t = 45 - 60). Specs Fibra: 200 um núcleo, 0,22 NA. Luz irradiância = 6-66 mW / mm 2, correspondendo a distância da ponta de fibra de 0,1-0,6 mm do local da injeção viral com potência de luz 5 mW emitida a ponta da fibra antes de tethering. As barras de erro representam o erro padrão da média. EYFPvs SSFO: ** p &lt;0,01; *** P &lt;0,001; efeito do tempo: #### p &lt;0,0001 (Direito) a confirmação histológica da colocação viral e de fibra óptica.. Imagem de fluorescência confocal adquirido em uma Leica TCS microscópio de varredura a laser SP5 foi usada para visualizar a colocação de fibra (de linha pontilhada) e expressão viral mediada (verde) no rato área tegmental ventral seguinte in vivo estimulação optogenetic. Neurônios de dopamina (TH +) são vistos em azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo 1. In vivo estimulação optogenetic:. A hiperatividade durante a estimulação VTA usando SSFO em camundongos TH :: Cre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tabela 1. irradiancias luz necessária para ativar opsins comumente usados. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsina Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> Densidade de Potência (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Propriedades </td></tr><tr><td> ON / OFF Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitação óptica: channelrhodopsins de ação rápida </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1,21 / 12 mseg </td><td> Incêndios até 40 Hz </td></tr><tr><td> Cheta 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0,86 / 8,5 mseg </td><td> Incêndios até 200 Hz </td></tr><tr><td> Chefe 20 </td><td> 450 </td><td> 1,65 mW </td><td> 1,62 / 12 mseg </td><td> Forma não-dessensibilização de ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540 nm) </td><td> 5/34 a 54 mseg0 nM </td><td rowspan="2"> Vermelho-deslocado </td></tr><tr><td> 3.2 mW (630 nm) </td><td> 67 ms (ON) na 630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitação óptica: de ação lenta rodopsinas canal </td></tr><tr><td> Estável função degrau opsina (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 mW (470 nm) </td><td> 20 ms / 29 min </td><td> Nova variante SFO; Estado mais aberto. Aberto por 470 nm, fechado por 590 nm </td></tr><tr><td colspan="4"> Inibição Optical </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2,5 ms / &lt;10 mseg </td><td> Inibição sustentada por 30 min 22 com luz constante * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 mseg </td><td> Mais sensível com fotocorrentes maiores do que eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Esta tabela é fornecida apenas como um guia; irradiâncias de luz específicas necessárias para a modulação neural deve ser confirmada de forma independente. </td></tr><tr><td colspan="5"> Validação experimental é importante verificar se a opsina, a estratégia de segmentação e parâmetros de estimulação de luz modular disparo neural da forma pretendida 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> A densidade de potência (mW / mm 2) refere-se à potência da luz iluminado numa dada área do tecido do cérebro e não se refere a energia de luz emitida a partir da ponta da fibra. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Use sempre a menor intensidade de luz possível, especialmente com a estimulação de luz prolongada. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. irradiancias luz necessária para ativar opsins comumente usados. Abreviações AAV = vírus adeno-associado DPSS = estado sólido bombeado diodo- <br/&gt; EYFP = reforçada proteína fluorescente amarela FC / PC = cleave flat / contato físico GFP = proteína fluorescente verde PBS = solução salina tamponada com fosfato PVC = cloreto de polivinila mW = miliwatt NA = Abertura numérica SSFO = estável-function passo opsina TH = tirosina hidroxilase TTL lógica = transistor-transistor V = voltagem VTA = área tegmental ventral

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

59.1K visualizações.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

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Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Neurociência

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...