Rastreamento de linhagem e análise clonal no desenvolvimento de córtex cerebral usando análise de mosaico com marcadores duplos (MADM)

A Análise mosaico com tecnologia Double Markers é um método poderoso que pode fornecer informações altamente quantitativas sobre o comportamento de proliferação e saídas de porões de células-tronco individuais. Uma característica única desta técnica, é que permite o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos no nível de Célula Única.demonização para o procedimento será, Carmen Streicher, sua técnica, Nicole Amberge, pós-doc, Gisselle Cheung, pós-doutor e Andy Hansen, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para induzir eventos de recombinação MADM em camundongos experimentais, use uma seringa de 1ml equipada com uma agulha de calibre 25 para fornecer uma única injeção de Tamoxifen Intraperitoneal em uma represa cronometrada para grávida. Da análise clonal madm aos pontos de tempo pós-natal. Nos dias embrionários de 18 a 19 dias, coloque um rato grávida na posição supina e desinfete a pele com 70% de etanol. Faça uma pequena incisão na pele no abdômen inferior acima do útero e faça uma segunda incisão através dos músculos e da parede muscular abdominal para revelar o peritônio. Use uma tesoura para separar o útero dos tecidos circundantes e colocar o útero intacto em uma luva com água morna. Em seguida, use uma tesoura de ponta fina e os dedos para abrir cuidadosamente as paredes uterinas para liberar os embriões. Limpe os filhotes pressionando suavemente os baús de tempos em tempos para iniciar a respiração antes de transferir os animais pré-natais para uma mãe adotiva. Para coletar tecido clone madm neural coloque um animal anestesiado na posição supina em uma bandeja de cirurgia de perfusão e desinfete a pele com 70% de etanol. Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão através da pele e uma incisão através da camada muscular. Quando a cavidade torácica estiver visível, fareje e levante o diafragma para revelar o coração e corte cuidadosamente e fixe a caixa torácica na bandeja cirúrgica.insira uma agulha conectada a uma tubulação de bomba peristáltica cheia de PBS no ventrículo inferior esquerdo do coração e use uma pequena tesoura Iris para fazer uma incisão na extremidade posterior do átrio direito. Perfuuse o sistema cardiovascular com o PBS seguido imediatamente por perfusão com gelo recém-preparado frio 4%paraformaldeído na PBS. Quando a perfusão estiver completa, remova o cérebro através de dissecção cuidadosa e coloque o órgão colhido em pelo menos cinco vezes o volume cerebral de fresco 4% de desformaldeído durante a noite em 4