Esses métodos podem ser usados para caracterizar respostas ao estresse em C.elegans e para determinar se perturbações genéticas ou farmacológicas afetam a ativação de vias celulares protetoras. Esses métodos permitem testes rápidos e de alto rendimento de centenas de perturbações, como o knockdown genético, tanto nos níveis molecular e fisiológico. Para garantir que o ensaio seja realizado corretamente, inclua controles positivos e negativos.
Sincronizar animais saudáveis e bem alimentados até o estágio adequado e usar placas frescas para o experimento. A visualização da micromanipulação dos worms com uma picareta pode ajudar os novos usuários a entender como os worms podem ser alinhados e avaliados para viabilidade. Os procedimentos serão Phil Frankino, Holly Gildea e Melissa Metcalf, estudantes de pós-graduação em nosso laboratório.
Para usar animais expressando GFP sob o promotor da proteína de choque térmico quatro para ativação do reticúlo endoplasmático desdobrado resposta proteica, crescer animais repórteres sincronizados a 20 graus Celsius até o estágio L4 e lavar os vermes da placa usando m9 médio e transferir para um tubo. Depois de coletar os vermes por centrifugação, substitua o M9 por 25 nanogramas por mililitro da droga de interesse em M9 ou sulfóxido de dimetil em M9 nos tubos de animais de controle. Em seguida, coloque os vermes em uma plataforma rotativa por três a quatro horas a 20 graus Celsius.
No final da incubação, centrifugar os vermes para se estabelecer antes de substituir a solução de tratamento por 15 mililitros de M9 sozinho. Após duas lavagens, transfira os animais para placas de NGM ou placas de interferência de NGM RNA conforme apropriado e permita que os vermes se recuperem durante a noite a 20 graus Celsius. Quando os vermes se recuperarem, adicione cinco a 10 microlitros de 100 mililitros de sódio em uma placa NGM padrão sem bactérias e coloque uma placa de vermes sob um microscópio dissecando.
Transfira de 10 a 20 animais da placa para o local do azida de sódio. Os animais devem aproveitar o movimento logo após o pouso na solução de sal. Uma vez que o azida de sódio tenha evaporado, alinhe os animais na configuração de imagem desejada com os lados anterior e posterior na mesma orientação para todos os animais e coloque imediatamente a placa de animais sob um microscópio estéreo.
Inicie o software de imagem de microscópio estéreo e sob a guia de aquisições, clique em projetos abertos e pasta para abrir um novo projeto. Clique com o botão direito do mouse e selecione renomear para renomear a pasta. Posicione a amostra de vermes sob o objetivo do microscópio e use a configuração Brightfield para localizar o ponto focal correto dos vermes para minimizar o branqueamento fluorescente.
O centro da amostra será o ponto em que a linha de ovos é claramente visível e não confuso. Defina o tempo de exposição para garantir que os pixels não estejam saturados e também para garantir que o sinal esteja acima do limite de detecção. Depois de definir o tempo de exposição, zoom, foco e condensadores Brightfield nas configurações apropriadas, clique no botão de imagem de captura para adquirir uma imagem.
Para imagens usando um microscópio composto de campo largo, coloque a placa de tratamento de controle da linha de base no estágio de microscópio de campo largo composto e use a almofada de toque para iniciar o programa de controle. Crie um novo álbum e nome de arquivo e posicione a placa sob a lente objetiva. Use o controle da linha de base e as placas de controle positivas para definir o tempo de exposição e a intensidade da fluorescência para que o sinal seja visível, mas não saturado.
Em seguida, salve imagens Brightfield e GFP FITC. Para quantificar a indução do repórter por grande citometria de fluxo de partículas, primeiro ligue os lasers do citógrafo e abra o software do citômetro. Clique para ligar os lasers na janela do software e clique em correr para iniciar o laser na janela popup de controle a laser de argônio.
Quando o laser atingir cerca de 12 miliwatts e o nível de fonte de luz 488 subir para cerca de 12, clique feito e verifique os quatro valores de pressão. Se os valores forem semelhantes aos observados na configuração original, verifique a caixa OK de pressão. Em seguida, para ter certeza de que não há bolhas de ar ou detritos bloqueando o fluxo da baia e amostra através da célula de fluxo, clique limpo várias vezes.
Em seguida, desligue a classificação e a baia para reiniciar o fluxo. Para verificar a vazão, recolha a baia por 60 segundos. Colete a baia em um tubo de 15 mililitros por 60 segundos.
A vazão deve ser de 9 a 10 mililitros por minuto. Para executar as amostras, ajuste a potência fotomultiplier do laser a um nível alto o suficiente para que o sinal esteja acima do limite de detecção, mas não superior ao limite de saturação. Realize o tamanho do gating para excluir bolhas, detritos, ovos e outras pequenas partículas indesejadas e incluir apenas os animais de interesse, como adultos.
Quando os parâmetros de triagem tiverem sido definidos, adicione os worms preparados a um copo e clique em adquirir. Observe para ter certeza de que todo o líquido não é levado para dentro da máquina, pois isso fará com que o citômetro de fluxo tome ar e crie bolhas dentro do detector. Quando a amostra estiver baixa e/ou animais suficientes tiverem sido coletados, clique em parar.
Para armazenar dados fechados com base apenas nas restrições de tamanho, clique na configuração, armazenamento de dados, somente fechado e fechado para salvar os dados. Em seguida, enxágue o copo de coleta com água deionizada e remova a lavagem por vácuo três vezes antes de repetir a análise com a próxima amostra. Para medir a sensibilidade ao estresse mitocondrial e oxidativo, adicione 50 a 75 microliters de Paraquat em M9 a 8 a 10 poços por condição de uma placa plana de 96 poços e transfira de oito a dez vermes por condição para cada poço de Paraquat.
A cada duas horas, toque suavemente na placa para fazer com que os animais vivos batam ou dobrem para permitir a pontuação do número de animais mortos por poço. Para medir a sensibilidade à temperatura dos animais, incubar os vermes por três a quatro dias a 20 graus Celsius antes de emplacar de 10 a 15 animais por placa por condição para um total de quatro a seis placas. Em seguida, coloque as placas em uma incubadora Celsius de 34 ou 37 graus e marque a sobrevivência do verme a cada duas horas como apenas demonstrado.
O repórter hsp-4 tem mínima impressão basal na ausência de estresse, mas exibe uma expressão robusta de GFP quando os animais são expostos ao estresse rídulo endoplasmático usando a droga Tunicamycin. Essas diferenças também podem ser quantificadas usando um grande citômetro de fluxo de partículas. Além disso, a indução do transgene sob estresse órticulo endoplasmático pode ser completamente suprimida pelo knockdown de XBP-1 via interferência de RNA.
Ensaios semelhantes podem ser realizados para medir o estresse mitocondrial, o estresse oxidativo e o estresse térmico. Respostas fisiológicas animais inteiras ao estresse também podem ser medidas usando vários ensaios de sobrevivência. Por exemplo, a exposição à Tunicamicycin é usada para medir a sensibilidade ao estresse rítmico endoplasmático.
A derrubada do gene XBP-1 resulta em um aumento significativo na sensibilidade à Tunicamiciccin. Além disso, a exposição ao agente químico Paraquat é usada para medir a sensibilidade ao estresse oxidativo e mitocondrial. O knockdown do gene DAF-2 resulta em um aumento significativo da resistência ao Paraquat.
A termotolerância pode ser medida determinando a sobrevivência de animais a temperaturas elevadas e pode ser traçada como uma curva de sobrevivência. Esses ensaios devem ser realizados pelo menos quatro a seis vezes e todas as réplicas devem ser plotadas umas contra as outras, pois a termotolerância demonstra uma variabilidade incrivelmente alta em comparação com outros ensaios de estresse. Ao fotografar animais, é fundamental definir os parâmetros de tal forma que não haja mais ou sob saturação de sinal e para garantir que os mesmos parâmetros sejam usados ao longo do experimento.
Os protocolos de imagem descritos aqui são favoráveis à triagem em larga escala, incluindo telas de genoma e são ótimos para estudos exploratórios e confirmatórios que podem ser seguidos pelos ensaios fisiológicos descritos.
