O novo método padrão de quantitação de ácidos húricos fornece uma análise mais precisa e precisa em comparação com os métodos regulamentares existentes, e também fornece um método padrão para a quantificação pura de ácido hidrábico fulvic. A vantagem deste protocolo é que ele fornece uma análise gravimétrica das concentrações de ácidos ácidos húbicos e hidrofóbicos em uma base livre de cinzas, e o processo de extração foi otimizado para obter as maiores recuperações de ácidos úmidos e fulvic de amostras. Demonstrando o procedimento estará Ryan Fountain, um químico analítico do nosso laboratório de química húmica.
Para preparar uma amostra sólida, use uma argamassa e pilão para esmagar aproximadamente cinco gramas da amostra a ser analisada até que 100% da amostra bem misturada possa passar por uma peneira padrão dos EUA, tamanho da malha número 200. Para determinar gravimetricamente o teor de umidade do pó, transfira aproximadamente dois gramas do pó da amostra em um barco de pesagem de alumínio pré-ponderado, e registe a massa do barco e da amostra. Em seguida, coloque o barco de pesagem em um forno de secagem a 102 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, coloque o barco em um dessecador para esfriar por pelo menos uma hora antes de pesar e registrar a massa do barco de pesagem e da amostra seca, em seguida, use a fórmula para determinar o teor de umidade como indicado. Para realizar uma extração de uma amostra sólida, pesar aproximadamente 2,5 gramas da amostra restante e registrar o peso em quatro locais decimais. Em seguida, carregue a amostra em um frasco de um litro Erlenmeyer e enxágue o barco de pesagem com água deionizada para remover todo o minério.
Encha o béquer de um litro com hidróxido de sódio de 0,1 molar e adicione uma barra de agitação magnética de cinco a sete centímetros para facilitar uma agitação rápida da amostra em 300 a 400 revoluções por minuto em uma placa de agitação. Quando a amostra estiver completamente misturada, evacue o espaço da cabeça do frasco com gás nitrogênio, depois sele a abertura do frasco com uma tampa hermética e coloque o frasco em uma placa de agitação para misturar de 300 a 400 rotações por minuto durante 16 a 18 horas. Para extração de material líquido, agite completamente a amostra para garantir que o líquido de ensaio seja homogêneo misturado, incluindo qualquer resíduo que possa ter caído no fundo do recipiente.
Pese aproximadamente cinco gramas do líquido de teste e regista o peso em quatro locais decimais. Em seguida, adicione o líquido a um cilindro graduado de um litro e encha o cilindro com hidróxido de sódio de 0,1 molar a um volume final de um litro. Use uma barra de agitação magnética para misturar rapidamente a amostra como demonstrado até que a amostra de teste seja completamente misturada antes de transferir a mistura para um frasco de um litro Erlenmeyer, em seguida, evacuar o espaço da cabeça com gás nitrogênio e agitar o conteúdo do frasco em 300 400 revoluções por minuto durante uma hora, como demonstrado.
Para remover materiais não solúveis de extratos alcalinos, no final da incubação de agitação, transfira a mistura para tubos de centrífugas adequados e centrifugar todo o volume da amostra a 4.921x G por 30 minutos à temperatura ambiente. No final da centrifugação, colete o supernanato alcalino contendo o ácido hórico e a fração fulvica, que contém o ácido hidróbico fulvico, em um frasco erlenmeyer limpo de um litro com uma barra de agitação magnética. Para precipitação de ácido húrico da fração fulvic, enquanto mexe o extrato alcalino coletado a 300 a 400 rotações por minuto em uma placa de agitação, insira uma sonda de pH na porção média da solução e adicione o ácido clorídrico concentrado de gota sábia até que um pH estável de pH 1.0 mais ou menos 0,1 seja atingido.
Uma vez que o pH esteja estável, remova a sonda e mexa, enxágue-as com água desionizada e sele o frasco com uma tampa apertada de ar. Deixe o frasco sentar-se por uma a seis horas até que o ácido húlico precipitado tenha se estabelecido até o fundo antes de centrifugar o extrato e precipitar ácido húlico a 4,921x G por uma hora. No final da centrifugação, despeje os supernantes contendo frações fulvic em um frasco erlenmeyer limpo de um litro e sele o frasco com uma tampa hermética.
Coloque os tubos de centrífuga contendo ácido húrico em um forno de secagem de 100 graus Celsius por 24 horas e certifique-se de que as tampas estejam soltas ou removidas para garantir a secagem. Depois de secar, esfrie os tubos em um desiccador até atingirem a temperatura ambiente. Após o resfriamento, use uma espátula para transferir o resíduo de cada tubo para um único barco de pesagem tared para determinar a massa da amostra de ácido hólico extraído.
Para determinar o teor de cinzas dentro da amostra, transfira aproximadamente 30 miligramas do ácido húlico seco para um prato cerâmico limpo e pré-pesado para determinar a massa da amostra de pesar e do prato. Em seguida, combustão o ácido húrico em um forno muffle por duas horas a 600 graus Celsius antes de esfriar o prato no desiccator. Uma vez frio, pese o prato e use a fórmula para calcular a razão das cinzas.
Para determinar a massa final do ácido puro húlico, use a fórmula para corrigir o teor de cinzas. Em seguida, use as fórmulas para determinar a concentração de ácido humico puro. Para preparar uma nova coluna de cromatografia de polimetila de baixa pressão DAX8, mergulhe a resina no metanol por duas horas em um béquer antes de enxaguar a resina completamente com água desionizada até que todo o metanol seja removido.
Em seguida, remova qualquer pequena partícula de resina flutuando na água. Uma vez completamente enxaguada, despeje a resina enxaguada ou regenerada em uma coluna de cromatografia de vidro de 5 por 25 centímetros equipada com uma peça final com um frit de 10 mícrons para suporte à cama de resina, deixando de 2,5 a 5 centímetros na parte superior da coluna e substitua a peça superior na coluna. Para reformar uma resina usada anteriormente, ou preparar uma nova resina recém-lavada, use a bomba peristáltica para bombear ácido clorídrico de 0,1 molar a uma taxa de fluxo de 35 a 40 mililitros através do fundo da coluna até que o pH do efluente seja igual ao pH do influente, em seguida, bombeie água desionizada para o topo da coluna até que o pH do efluente seja igual ao pH do influente.
Uma vez que a cama de resina esteja embalada, use uma bomba peristáltica para carregar a fração fulvic na coluna sob baixa pressão através da parte superior da coluna a uma taxa de fluxo de 35 a 40 mililitros. Uma vez que a fração fulvic tenha sido completamente carregada sobre a resina, lave a resina com água desionizada para remover a fração de fulvic hidrofílico não adsorvida. Lave a coluna com água deionizada até que a absorção do efluente da coluna a 350 nanômetros seja igual à da água deionizada usada para lavar a coluna.
Para desordenar o HFA, bombeie hidróxido de sódio 0,1 molar através do fundo da coluna e capture o efluente fulvate de sódio da bomba em um recipiente limpo e de tamanho suficiente. Todo o HFA foi dessordado quando a absorção do efluente da coluna é igual à absorvência de 0,1-molar fluido de hidróxido de sódio a 350 nanômetros. Para desarbrar o HFA por protonação, primeiro despeje a resina de troca de próton/cáção em um grande béquer e cubra e misture a resina com água desionizada fresca várias vezes, derramando a água após cada lavagem até que a cor vermelha tenha sido completamente removida.
Após a última lavagem, cubra a resina com um ácido clorídrico molar e deixe a mistura descansar por pelo menos duas horas, mexendo a cada 30 minutos. No final do tratamento de acidificação, substitua o ácido por água desionizada e mexa vigorosamente com uma haste de agitação por 15 segundos antes de deixar a resina cair para o fundo do frasco e derramar a água. Repita o processo até que a condutividade elétrica da água enxágue seja menor ou igual a 0,7 microSiemens por centímetro e carregue a resina regenerada em uma coluna de 5 por 50 centímetros com um frit de vidro para reter a resina.
Em seguida, cubra a resina com água deionizada fresca e passe repetidamente o fulvato de sódio através da forte resina de cátion/prótons trocada por alimentação gravitacional até que a condutividade elétrica do efluente seja inferior a 120 microSiemens por centímetro. Para garantir que toda a FA seja removida da resina, após a passagem final, lave a resina com água desionizada até que a absorção do efluente a 350 nanômetros seja a mesma da água deionizada usada para lavar a coluna. Adicione a lavagem e qualquer efluente usado para verificar a absorvência à solução FA purificada.
Para ajudar na remoção da FA, a resina pode ser agitada várias vezes. Use um evaporador rotativo a 55 graus Celsius para concentrar a FA em um volume de aproximadamente 15 mais ou menos dois mililitros e transfira completamente todo o volume de concentrado fa para um tubo de centrífuga de plástico de 50 mililitros. Seque a amostra para 60 mais ou menos três graus Celsius para ressecamento constante no forno de secagem e transfira o tubo para o desiccador esfriar.
Quando a amostra tiver esfriado, use uma espátula para raspar a FA extraída em um pedaço de papel de peso pré-pesado e determinar a razão de cinzas, o peso extraído da FA e por cento de FA pura na amostra original, como demonstrado para o ácido húlico. Nesta tabela, são mostrados dados de precisão para o método de extração de HA e HFA a partir de amostras comerciais líquidas com concentrações muito diferentes de HA e HFA. O desvio padrão residual para HA foi inferior ao do HFA, mas o desvio padrão residual médio de HFA sobre três amostras líquidas foi de 6,83%, indicando um alto grau de precisão.
A razão Horowitz também foi maior que duas para apenas uma das análises da HFA. Nesta tabela, são mostrados dados de precisão para a extração de HA e HFA a partir de três amostras de minério húlico. Semelhante à análise anterior, com exceção do HFA extraído do minério dois e do HA do minério três, todas as razões horowitz estavam abaixo de duas, demonstrando o alto grau de precisão deste método para a extração de HA e HFA a partir de amostras de minério úmido.
Nesta análise, não foram observados aditivos bioestimulantes vegetais que afetaram significativamente a recuperação de HA ou HFA. Nestas tabelas, mostram-se as recuperações de HA e HFA a partir de amostras líquidas que estimularam produtos comerciais com concentrações muito baixas. As recuperações foram excelentes, variando entre 88% e 97% para HA, e 92% e 104% para HFA, mas também indicando a necessidade de realizar réplicas laboratoriais.
Após este procedimento, os ácidos úmidos secos e fulvic obtidos podem ser usados para fins de caracterização, como o carbono-13 e a ressonância eletrônica de próton NMR, e a espectrometria de massa de resolução ultra-alta, entre outras técnicas úteis. E isso pode ser usado para a caracterização da química do húmus, bem como ferramenta útil para aprofundar a relação estrutura-atividade com a aptidão das plantas e os mecanismos de defesa das plantas subjacentes.
