Este protocolo modular permite explorar múltiplos eventos moleculares realizados por lipídios estruturais e sinalizadores, e/ou RNAs, em regiões discretas de tecido e no sangue com uma melhor saída quantitativa e qualitativa de dados por amostra. O método é aplicável a qualquer modelo experimental, e também pode ser aplicado a amostras de tecido humano e sangue. Demonstrando o procedimento estarão Claudia Schwitter, técnica, Julia Post, estudante de pós-graduação, e Raissa Lerner, pós-doutora do meu grupo.
Para começar, tome cérebros congelados previamente isolados, inteiros e congelados de camundongos com epilepsia aguda e profiliamente tratada com ácido kainico. Monte os cérebros no sistema de montagem do criostat. Ajuste a espessura para 50 micrômetros e corte o cérebro no modo de corte perto da região de interesse.
Ao se aproximar da região de interesse, coloque a espessura entre 18 e 20 micrômetros. Para localização da sub-região de interesse, colora fatias cerebrais usando azul toluidina. Use um microscópio para inspecionar as fatias manchadas para identificar as regiões de interesse a serem perfuradas, e use um atlas de rato como referência para encontrar as regiões anatômicas cerebrais apropriadas.
Use corers de amostra para levar socos de 0,8 a 1,0 milímetros de diâmetro. Transfira os socos para endocanabinóides e coextrações eicosanoides em tubos âmbar pré-resfriados de 2 mililitros com sete bolas de aço pré-resfriadas por tubo. Para fosfolipídios e endocanabinóides coextração, dupla lipídica e co-extração de RNA, transfira os socos em tubos de extração sem RNase de 2 mililitros com contas de cerâmica.
Pesar socos congelados na sala fria e imediatamente proceder com extração ou congelamento a 80 graus Celsius. Para realizar a coextração lipídica líquido-líquido de endocanabinóides e eicosanoides de pedaços cerebrais, socos ou amostras de pó de tecido, coloque os tubos de extração contendo as amostras de tecido e sete bolas de aço no gelo. Adicione 600 microliters de MTBE gelado e 50 microlitres de água acetonitrila contendo os padrões internos.
Depois de adicionar 400 microliters de ácido fórmico molar 0,1, use um liser tecidual para homogeneizar por 30 segundos a 1 minuto. Centrifugar este homogeneizar por 15 minutos a 5.000 vezes g a 4 graus Celsius. Coloque-o no congelador por 10 minutos a 80 graus Celsius para congelar a fase inferior aquosa, o que facilitará a transferência da fase orgânica superior.
Transfira a fase orgânica superior para novos tubos âmbar de 1,5 mililitro, evapora sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, reconstitua em 50 microliters de água acetonitrila para análise posterior. Armazene a fase aquosa a 20 ou 80 graus Celsius para análise adicional de teor de proteínas. Para coextratar endocanabinóides e eicosanoides de amostras de plasma, coloque as amostras de plasma congelados no gelo e deixe-as descongelar completamente.
Adicione 800 microliters de MTBE e 50 microliters de água acetonitrila contendo os padrões internos otimizados para o espetamento usando amostras de plasma de referência. Adicione 600 microliters de ácido fórmico de 0,1 molar e vórtice a 4 graus Celsius por 2 minutos. Centrifugar as amostras a 4.000 vezes g por 15 minutos a 4 graus Celsius.
Transfira a fase orgânica para novos tubos. Evapora-o sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius, e depois reconstitui-o com 50 microliters de água acetonitrila para análise de monitoramento de reação múltipla de cromatografia líquida. Para realizar a coextração de fosfolipídios e endocanabinóides de regiões cerebrais, socos ou outras amostras de pó de tecido, coloque os tubos de extração contendo amostras de tecido e contas de cerâmica no gelo.
Adicione 800 microliters de metil tert-butil e mistura de metanol e 10 microliters de metanol contendo os padrões internos. Em seguida, adicione 200 microliters de ácido fórmico de 0,1% contendo 25 micromolar de tetrahidrolipstatina/URB597 e 50 microgramas por mililitro de BHT. Após homogeneizar com um homogeneizador de tecido, centrífuga a 5.000 vezes g e 4 graus Celsius por 15 minutos.
Transfira a fase orgânica superior em novos tubos, evapore sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius, e depois reconstitua este extrato lipídico com 90 microliters de metanol. Se prosseguir imediatamente, adicione 10% de água a uma alíquota de extrato lipíduo e injete 10 microliters na LC/MS para análise fosfolipídica. Para uma análise mais endocanabinoide, prossiga com o próximo passo.
Pegue uma alíquota do extrato lipídico, evapore até o ressecamento e reconstitua em água de acetonitrila. Para realizar a extração dupla de RNA e lipídios e coextração de fosfolipídios e endocanabinóides de amostras de tecido, descongelar alíquotas de pó de tecido ou cachos cerebrais a 4 graus Celsius. Adicione o tecido aos tubos de extração com contas de cerâmica.
Em seguida, adicione 600 microliters de tampão RLT juntamente com 200 microliters de clorofórmio. Para coextração fosfolipídida e endocanabinóide, espetar amostras com 10 microliters de mistura padrão interna e homogeneizar em alta velocidade por 20 segundos. Transfira amostras homogeneizadas em novos tubos de centrífuga e centrífuga por cinco minutos a toda velocidade e 4 graus Celsius para permitir a separação da fase.
Transfira a fase superior para um tubo fresco para extração de RNA usando um kit padrão. Elute extraiu RNA em um volume total de 50 microliters de água sem RNase e armazena-lo a 80 graus Celsius. Para extração lipídica, adicione 800 microliters de MTBE/metanol e 200 microlitres de ácido 0,1% paramórmico à fase mais baixa que contenha clorofórmio.
Vórtice por 45 minutos a 4 graus Celsius. Transfira a fase orgânica superior para um novo tubo. Evaporar-o sob um fluxo suave de nitrogênio a 37 graus Celsius.
Para posterior análise de LC/MS, reconstitua a amostra em 90 microliters de metanol e armazene-a a 20 ou 80 graus Celsius, ou proceda imediatamente à análise. Para uma análise mais endocanabinoide, prossiga com o próximo passo. Pegue uma alíquota do extrato lipídico, evapore até o ressecamento e reconstitua em água de acetonitrila.
Em seguida, injete 20 microliters na LC/MS para análise endocanabinoide. A indução de ácido kainico de convulsões epilépticas agudas levou a uma intensidade de convulsão máxima de uma hora após a injeção. O perfil lipidomico de endocanabinóides e eicosanoides, bem como fosfolipídios e endocanabinóides, mostra alterações lipídicas no córtex cerebral, estriado, região tálamo, hipocampo, hipotálamo, cerebelo, bem como tecido cardíaco e pulmonar em camundongos e controles epilépticos induzidos por ácido kainico.
Após a extração dupla de fosfolipídios e endocanabinóides e RNA para perfil quantitativo de socos cerebrais de camundongos, analisou-se a distribuição quantitativa de lipídios no hipotálamo, amígdala basolateral e hipocampo ventral e dorsal. Níveis de expressão relativa de enzimas e receptores endógenos envolvidos na sinalização lipídica, bem como marcadores para atividade cerebral investigados no nível mRNA em diferentes regiões cerebrais e sub-regiões de camundongos submetidos a convulsões e controles epilépticos induzidos por ácido kainico. A epilepsia induzida por ácido kainico causou perda maciça de sinal de NeuN, predominantemente na região de CA1, CA3 e hilus do hipocampo, acompanhada por eventos apoptóticos indicados pelo sinal caspase-3 em comparação com o controle de camundongos injetados em soro fisiológico.
Após o tratamento com palmitoylethanolamida subcrática, o sinal de proteína dos núcleos neuronais foi visivelmente preservado e o sinal CASP3 mal foi detectável. Socos cerebrais e dissecção de áreas cerebrais discretas são bastante desafiadores e requerem habilidades finas para obter amostragem consistente em várias coortes. Portanto, a prática em órgãos de teste e o bom conhecimento da morfologia cerebral são altamente recomendados.
