Este protocolo permite a caracterização e o uso de microcoils para ressonância magnética de campo ultra alto. A ressonância magnética é uma ferramenta única e não invasiva para explorar propriedades de fisiologia, metabolismo e difusão de espécimes biológicos. Utilizando alta resistência do campo magnético e microcoils adaptados a uma amostra de interesse, imagens de até resolução celular podem ser obtidas.
Neste método, descrevemos passo a passo como determinar as características de microcoils comerciais ou caseiros para aplicações de imagem. Usamos espécimes biológicos menores que um milímetro de diâmetro e um espectrômetro nmr vertical de campo ultra alto. Usando microcoils caseiros, podemos ajustar o tamanho da bobina de radiofrequência ao tamanho da amostra.
Nesta pesquisa, estamos usando um pequeno pedaço de raiz vegetal. Isso é útil porque a sensibilidade da bobina é proporcional à diminuição do diâmetro da bobina. Portanto, podemos obter imagens com maior relação sinal/ruído para pequenas amostras.
Devido ao pequeno tamanho e à natureza frágil desses microcarros, é importante estabelecer alguns parâmetros básicos, como, por exemplo, o comprimento do pulso de 90 graus e a potência de pulso, os limites operacionais seguros e, finalmente, calcular a sensibilidade da bobina de uma forma que possa ser comparada em diferentes sistemas de RMR. O microcoil solenoide consiste em um fio enrolado em torno de um capilar e dois capacitores: o ajuste e o capacitor correspondente. O capacitor de ajuste é escolhido para alcançar a frequência ressonante desejada de 950 mega-hertz, enquanto o capacitor correspondente optou por alcançar a transmissão máxima de sinal.
É uma impedância de 50 Ohm. O capacitor maior é variável para permitir um ajuste mais fino. A bobina fica sobre uma placa base que é fixada em um soquete modificado.
Opcionalmente, um reservatório para fluido de correspondência de suscetibilidade pode ser adicionado para reduzir os efeitos de suscetibilidade do fio da bobina. Em um relógio de vidro transfira um mililitro de perfluorodecalina, ou PFD, que será usado para submergir a amostra. PfD é usado, pois pode preencher espaços aéreos no espécime sem entrar em células biológicas.
Também não é observável pela ressonância magnética de prótons. Cubra imediatamente o PFD com uma tampa de placa de Petri para evitar a evaporação antes que seja necessário. Se preparar uma amostra de referência, use uma solução de sulfato de cobre.
Em seguida, extraia cuidadosamente um sistema radicular de seu substrato de crescimento. Extirpar uma pequena seção usando um bisturi. Para tratamento a vácuo, coloque a amostra em um tubo Eppendorf contendo uma solução fixa.
Em seguida, sele o tubo com um filamento e furos para permitir a ventilação. Submeter a amostra ao tratamento a vácuo. Bolhas de ar podem ser vistas escapando da amostra.
Ao olhar através de um microscópio estéreo use pinças para submergir tanto a amostra quanto capilar na solução preparada anteriormente. Em seguida, insira a amostra no capilar usando pinças enquanto capilar e amostra de uma totalmente submersa. Use uma capilar menor ou uma ponta de agulha de seringa como uma haste de empurrar.
Modele o papel de tecido em um ponto fino e use-o para remover cerca de um milímetro de líquido de ambas as extremidades do capilar. Derreta, um pequeno volume de cera capilar usando uma caneta de cera. Aplique cera em ambos os lados.
A cera ficará opaca quando se solidificar. Tome cuidado para excluir bolhas de ar do capilar. Depois, raspe o excesso de cera usando um bisturi.
Insira a amostra no microcoil usando pinças, mantendo a microcoil estável. Use uma haste para centralizar a amostra na bobina. Se a bobina for testada pela primeira vez, utilize uma amostra de referência de sulfato de cobre para calibração de potência e determinação da homogeneidade do SNR e do campo B1.
Este protocolo é demonstrado em um espectrômetro de furo vertical 22.3 Tesla equipado com uma micro sonda de imagem com bobinas de gradiente integradas, capazes de até três Tesla por metro. Conecte o microcoil à base da sonda, mantendo a microcoil na vertical. Em seguida, deslize sobre a bobina de gradiente do eixo triplo.
Gire a rosca do parafuso na base da sonda para fixar o gradiente no lugar. Insira a sonda no ímã e faça as conexões necessárias. Inicie uma curva de oscilação e ajuste a sintonia e correspondência conforme necessário.
Recomenda-se começar com uma largura de varredura espectral alta. Esteja ciente de que vários modos ressonantes podem estar presentes. Testes SNR para cada modo podem ser necessários para determinar o modo ressonante correto.
Selecione a configuração correta da bobina para o microcoil. Caso os limites de segurança para as bobinas sejam desconhecidos, comece com 10 microsegundos a uma potência de pulso baixa de 0,6 watts e aumente lentamente o comprimento do pulso em um microssegundo de cada vez até que um sinal apareça. Regisso uma curva de noz para uma nova bobina para obter o comprimento e potência corretos do pulso para o pulso de 90 graus.
Para isso, varie sistematicamente a duração do pulso, mantendo a energia do pulso constante. No caso de um campo B1 inhomogêneo, o pulso de 90 graus pode ser estimado a partir dos comprimentos em que a intensidade máxima do sinal é obtida. Use uma escala de localizador com grande campo de visão para localizar a posição da bobina dentro do ímã.
Se a amostra estiver exatamente no centro do sistema de gradiente, a varredura do localizador mostrará a amostra. Se a bobina ou amostra estiver fora do centro, ajuste a varredura do localizador. Uma vez que uma potência de pulso aproximada é encontrada usando a curva de nutação, varie os poderes de pulso gradualmente para uma série de imagens para verificar a imagem mais homogênea.
Para algumas bobinas com um campo B1 inhomogêneo, o pulso determinado de 90 graus pode ser superestimado levando ao excesso de cobertura no ponto doce desejado da bobina. Shim manualmente o campo magnético com base no sinal FID. Dependendo da orientação dos calços dos microcoils com orientação diferente pode resultar em uma correção mais forte da homogeneidade B0.
Em seguida, deve-se calcular um SNR normalizado de volume. Primeiro, calcule o volume do voxel multiplicando a resolução X e Y vezes a espessura da fatia. O SNR é calculado subtraindo o ruído médio do sinal médio e dividindo-o pelo desvio padrão do ruído multiplicado pelo volume voxel.
O sinal médio é retirado do centro da imagem, enquanto o sinal de ruído é calculado a partir das manchas de canto. Execute uma sequência de eco de vários gradientes para verificar possíveis problemas de suscetibilidade devido ao fio da bobina e à própria amostra. Para bobinas submersas, a diferença de suscetibilidade entre os fios da bobina e seu ambiente é muito reduzida.
Imagens de alta resolução talvez alcançadas com experimentos flash 3D. Várias características radiculares podem ser distinguidas, como a endoderme, córtex e xilema, que são difíceis de resolver usando bobinas maiores. Multislice, sequências multiecho também podem ser usadas para reduzir a influência da suscetibilidade.
No entanto, isso vem ao custo de menor sensibilidade por unidade de tempo. Nódulos radiculares de truncatula Medicago também podem ser imagens usando este protocolo. Uma resolução isotrópica de 31 micrômetros foi obtida em quatro minutos, enquanto uma resolução isotrópica de 16 micrômetros foi obtida em 33 minutos.
Isso permite que vários aspectos fisiológicos de pequenos nódulos radiculares sejam estudados em detalhes. Para uma preparação amostral bem sucedida, é importante submergir completamente tanto a amostra quanto a capilar no líquido. Isso impede a formação de bolhas de ar que afetam negativamente a qualidade da imagem.
Como a imagem de MR não é destrutiva, podemos remover a amostra biológica após a varredura de Ressonância Magnética e usá-la para estudos posteriores usando, por exemplo, microscopia óptica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão básica da caracterização e operação de microcoil para aplicações de imagem. Isso pode ser aplicado a uma grande variedade de espécimes biológicos.
