Este trabalho foi financiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde Grant GM 69829.

1. Medição de agonista curvas concentração-resposta: sem atividade constitutiva <ol><li> Para a estimativa de valores em relação agonista K b (RA i), uma série de pelo menos dois agonista curvas concentração-resposta é necessária. Qualquer ensaio in vitro para a resposta funcional de um GPCR pode ser medida desde que a concentração de agonista pode ser controlada e um único tipo de receptor medeia a resposta. Adequada baseada em células incluem ensaios de medição de AMPc 4,7 e acumulação inositolphosphate 8,9 em uma linha de células expressando um receptor recombinante. Exemplos de ensaios de tecido inteiro incluem a medição da contração do músculo liso 10 ou M-receptor e 2 muscarínicos β 1-adrenoceptor mediada alterações na contração do rato em campo estimulado átrio esquerdo 11. </li><li> Escolha uma série de agonistas para análise, incluindo um agonista altamente eficaz(Ligante, por exemplo, endógena). Em um determinado experimento, medida completa curvas concentração-resposta para cada agonista. Se o número de agonistas é muito grande para completar o ensaio em um único experimento, divide os agonistas em subgrupos, cada um consistindo de um número razoável de agonistas para um único experimento. Para cada subgrupo, medir a curva de concentração-resposta do agonista altamente eficaz, juntamente com os dos outros agonistas no subgrupo (ver Figura 3). Repita a experiência para cada subgrupo 3-6 vezes, aproximadamente, dependendo da variabilidade dos dados. </li><li> Para cada curva de concentração-resposta, medir a resposta na ausência de agonista (resposta basal), e na presença de concentrações crescentes de agonista. Espaço as concentrações agonista uniformemente em uma escala log aproximadamente a cada 0,3-0,7 log 10 unidades, que cobrem a gama de respostas e na definição da resposta máxima (E máx) (ver Figura 3). Para experimentos em linhas de células, cada medição é feita em triplicado. </li><li> Subtrair a resposta basal daquele medido na presença de cada concentração do agonista. As respostas plotados na Figura 3 foram calculados desta maneira. </li></ol> 2. Análise preliminar de agonista curvas concentração-resposta: sem atividade constitutiva <ol><li> Inserir os dados dos experimentos concentração-resposta (por exemplo, a Figura 5) em uma tabela de dados em Prism. Todas as concentrações de agonista log são inseridos sob a coluna marcada X. As medidas de resposta para o agonista que parece ter o maior valor máximo E é introduzido na coluna A, e aqueles para o agonista que as outras pessoas entraram em colunas adjacentes letras. Medições repetidas de uma das curvas concentração-resposta são inseridos no sub-colunas de uma determinada coluna com letras. </li><li> Seleccione a folha de gráfico em que os dados são plotados, e analisar os dados por análise de regressão não-linear usandodireito da equação, log (agonista) versus resposta - inclinação variável (quatro parâmetros). Restringir o &quot;Bottom&quot; parâmetro para zero, e realizar a análise de regressão. Copie o &quot;Top&quot; (E max) e log EC 50 parâmetros em uma planilha Excel para uso no cálculo das estimativas dos parâmetros iniciais. O agonista com a maior estimativa de E max é designado como o &quot;agonista padrão&quot;, enquanto os outros agonistas são designados como &quot;agonistas teste&quot;. </li><li> Calcular a estimativa inicial de log τK obs (LOGR1) como o log negativo CE 50 valor do agonista padrão (log-CE 50 &#39;). Calcular a estimativa inicial do RA log i valor de cada agonista de teste (LOGRA) como log {(Top * EC 50 &#39;) / (Top&#39; * EC 50)}, em que os parâmetros do agonista padrão são indicadas com um apóstrofo . Calcular o log afinidade conbalcões dos agonistas de teste (LOGK2 - LOGK5) como o logaritmo negativo de seus respectivos valores de CE 50. </li></ol> 3. Estimativa de valores agonista RAi usando análise de regressão não-linear: nenhuma atividade constitutiva <ol><li> Inserir os dados em uma tabela de dados no Prism, como descrito acima no ponto 2.1. Certifique-se que os dados para o padrão agonista são inseridos na coluna A. </li><li> Digite um user-defined equação, &quot;log RAi&quot;, em Prism em várias linhas, como mostrado para o caso envolvendo um total de cinco agonistas: <ul><li> &lt;A&gt; P = LOGK1 </li><li> &lt;A&gt; Q = LOGR </li><li> &lt;~ A&gt; Q = + LOGR LOGRA </li><li> &lt;B&gt; P = LOGK2 </li><li> &lt;C&gt; P = LOGK3 </li><li> &lt;D&gt; P = LOGK4 </li><li> &lt;E&gt; P = LOGK5 </li><li> Y = Msys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M}) </li></ul></li><li> Inscreverá as estimativas iniciais dos parâmetros da seguinte forma: Digite um valor arbitrariamente baixa de 0 para a constante de afinidade log (LOGK1) do agonista padrão. Digite a estimativa inicial dosLOGR e as constantes de afinidade (LOGK2 - LOGK5) e log valores Rai (LOGRA) dos agonistas de teste. Atribuir a estimativa inicial do fator de inclinação transdutor (M) um valor de 1.0. Atribuir a estimativa inicial para a resposta máxima do sistema (Msys) um valor equivalente ao máximo E do agonista padrão (Top). </li><li> Aplicar as restrições seguinte parâmetro: LOGK1 restrito ao constante, 0; LOGR1, Msys e M, valor compartilhado para todos os conjuntos de dados; LOGK2 - LOGK5 e LOGRA, sem restrições. </li><li> Iniciar a análise de regressão não-linear. Os resultados de rendimento do K log obs e RA log i valores dos agonistas de teste. Se o padrão agonista é um agonista completo, então o tanto o log K obs e valores log RA i são precisos. Se o agonista mais eficaz (agonista standard) é na verdade um agonista parcial, então o K obs valores da ag mais eficazonists pode ser superestimada. No entanto, as estimativas de log RA i ainda são precisos nesta situação. </li><li> Se a regressão não convergir, o experimentador pode querer construir a curva teórica definida pela estimativa do parâmetro inicial. Se existem grandes desvios entre os pontos de dados e as curvas teóricas, verifique o cálculo da estimativa do parâmetro inicial. Se um ou mais agonistas têm E max valores equivalentes ao do agonista padrão, pode ser necessário para restringir sua log K obs valores a 0 para a regressão a convergir para uma solução. </li></ol> 4. Medição de agonista curvas concentração-resposta na célula com base em ensaios exibindo atividade do receptor constitutivo <ol><li> Para a estimativa dos valores agonista K b em unidades absolutas de M -1, baseada em células em ensaios in vitro são utilizados, que exibem atividade do receptor constitutivo. Constituiçãotiva atividade do receptor é definida como o aumento da resposta acima do nível basal causados ​​pela expressão do receptor de interesse. </li><li> Escolha agonistas e desenho do experimento, como descrito acima no ponto 1.2. </li><li> Para cada curva de concentração-resposta, medir a resposta na ausência de agonista não-transfectadas células (resposta basal) e em células transfectadas com o receptor de interesse (resposta basal + resposta constitutiva). Medir a resposta na presença de diferentes concentrações dos agonistas diferentes, conforme descrito acima na Seção 1.3. </li><li> Calcular a atividade do receptor constitutivo ea resposta a cada concentração do agonista como a resposta medida menos a resposta basal em células não transfectadas com o receptor. A Figura 6 mostra as respostas aos agonistas vários calculado desta maneira para uma via de sinalização exibem muito baixa atividade constitutiva. </li></ol> 5. Preliminar umalysis agonista de curvas concentração-resposta exibindo atividade constitutiva <ol><li> Inserir os dados (por exemplo, a Figura 6) em uma tabela de dados no Prism conforme descrito na Seção 3.1, mas também inserir a resposta causada pela atividade do receptor constitutivo nas colunas apropriadas letras que corresponde a uma concentração de agonista log de -20. A grande logaritmo negativo é inserido para uma concentração aproximada agonista de zero. </li><li> Analisar os dados, conforme descrito acima na Seção 2.2, mas com o parâmetro &quot;Bottom&quot; limitada, de forma que é &quot;compartilhada por todos os conjuntos de dados.&quot; Copie o &quot;Top&quot; (E max), compartilhada &quot;Bottom&quot; e log EC50 parâmetros em uma planilha Excel para uso no cálculo das estimativas dos parâmetros iniciais. </li><li> Calcular as estimativas iniciais dos parâmetros da seguinte forma: A afinidade log constante do agonista padrão (LOGK1) ou qualquer agonista completo de ensaios, deve ser determinada em experimentos separados como descrito anteriormente 3 </sup&gt;. Calcular a estimativa inicial do log K obs valor de cada teste agonista parcial (ou seja, somente LOGK2 neste caso) como log {(Top&#39; Top) / (EC 50 (Top&#39; Bottom-))}, em que &quot;Bottom &quot;denota a resposta causada pela ativação do receptor constitutivo. Calcular a estimativa inicial de log K b (LOGKb) para cada agonista como log {Top / (EC 50 Bottom)}. Calcular a estimativa inicial de log τ sys (LOGTsys) como log {/ Inferior (&#39;Top - Bottom)}. </li></ol> 6. Estimativa de valores Kb agonista de respostas exibindo atividade do receptor constitutivo usando análise de regressão não-linear <ol><li> Inserir os dados em uma tabela de dados no Prism, como descrito acima no ponto 3.1 </li><li> Digite um user-defined equação, &quot;Log Kb&quot;, em Prism em várias linhas, como mostrado para a condição de dois agonistas: <ul><li> &lt;A&gt; LOGKOBS = LOGK1 </li><li> &lt;B&gt; LOGKOBS = LOGK2 </li><li> A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1 </li><li> B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB) </li><li> C = (10 ^ (LOGTSYS)) </li><li> Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]} </li></ul></li><li> Inscreverá as estimativas iniciais dos parâmetros da seguinte forma: Digite as constantes de afinidade de cada um agonista (LOGK1 - digite o valor determinado no passo 5.3). Digite o K obs estimativas de cada agonista de teste. Inscreverá as estimativas Kb dos agonistas. Digite log τ sys estimativa (LOGTsys). Atribuir o fator de inclinação transdutor (M) e da resposta máxima do sistema (Msys) valores de 1,0 e &#39;Top (E max do agonista padrão), respectivamente. </li><li> Aplicar as restrições seguinte parâmetro: LOGTsys, Msys e M, valor compartilhado para todos os conjuntos de dados; LOGK2 e LOGKb, sem restrições. </li><li> Iniciar a análise de regressão não-linear. Os resultados de rendimento do log K b do agonista padrão, o log K obs </sub&gt; e os valores de log K b de agonistas parciais, e da resposta máxima do sistema (Msys), o valor de τ sys para o complexo receptor livre (LOGTsys), eo fator de inclinação transdutor no modelo operacional (M). </li><li> Se a regressão não convergir, siga os passos descritos acima no ponto 3.6. </li></ol> 7. Resultados representante A Figura 5 mostra alguns dos nossos dados publicados anteriormente em muscarínicos induzida por agonista hidrólise fosfatidilinositol em células de ovário de hamster chinês expressando estavelmente o receptor muscarínico M 3 12. As curvas de concentração-resposta de agonistas muscarínicos selecionados foram medidos neste ensaio. Os dados foram analisados, conforme descrito acima na secção 3 para estimar o valor de K b de cada agonista, expressa em relação à de oxotremorine-M. Estas estimativas log RA i são, carbacol, -0,56 ± 0,063; Arecolinha, -0,60 ± 0,074; pilocarpina, -1,20 ± 0,15; e McN-A-343, -1,92 ± 0,31. As curvas teóricas representam o ajuste por mínimos quadrados da equação de regressão aos dados (seção 3.2). As estimativas correspondentes da resposta máxima do sistema (M sys) eo fator de inclinação transdutor (M) foram 53,9 ± 1,3 e 1,15 ± 0,09, respectivamente. O log K obs valores dos agonistas, excepto a oxotremorine-M foram, carbacol, 5,19 ± 0,14; arecolina, 5,49 ± 0,12; pilocarpina, 5,58 ± 0,16 e McN-A-343 de 5,27 ± 0,33. A Figura 6 mostra os resultados de experiências sobre a hidrólise de agonistas muscarínicos estimulado fosfatidilinositol em células HEK 293 estavelmente expressar G α15 3. Expressão transitória do 3 M receptor muscarínico causou um aumento na hidrólise de fosfatidilinositol basal, que foi atribuída a atividade constitutiva do receptorlidade. Os dados foram analisados ​​para estimar os valores log K b de oxotremorine-M e McN-A-343 como descrito na secção 6. Esta análise resultou em valores de log K b de 8,30 ± 0,59 e 6,59 ± 0,77 para oxotremorine-M e McN-A-343, respectivamente. As curvas teóricas representam o ajuste por mínimos quadrados da equação de regressão aos dados (ver Seção 6.2). As estimativas de log τ sys, sys M e M foram -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 e 0,72 ± 0,08, respectivamente. A estimativa do valor de K obs 343-McN-A foi 5,35 ± 0,46. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig1.jpg" /> Figura 1. Relação entre a atividade do receptor único e do nível médio de ativação do receptor população. Atividade do receptor único, o comportamento teórico de um único receptor submetidos Transitions entre ativo (On) e inativos (Off) afirma, na presença de um agonista é mostrado. As constantes de afinidade do agonista para os estados ativo e inativo são denotados por K b e K, respectivamente. Comportamento da população, o comportamento teórico de vários receptores submetidos transições aleatórias entre os estados ativo e inativo na presença de um agonista é mostrado. População média, o nível médio de ativação do receptor em uma população de receptores na presença de uma concentração específica de agonista é mostrado. O nível de ativação da população receptor é conhecido como o estímulo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig2.jpg" /> Figura 2. Relação entre a função de ativação de receptores ea eficácia (ε) e constante de afinidade observada (obs K) da média agonista. População, o nível médio deativação do receptor provocada por aumento das concentrações de agonista é mostrado. ativação do receptor, o nível médio de ativação do receptor agonista é plotado a concentração log de ​​agonista. A concentração de log negativo de agonista necessário para que metade-máxima ativação do receptor é equivalente à afinidade de log observado constante do agonista (log K obs). O máximo da função de ativação do receptor é denotado como eficácia (ε). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplos de curvas concentração-resposta para a estimulação de [3 H] acumulação inositolphosphate por vários agonistas muscarínicos em células de ovário de hamster chinês expressando o ser humano M 3 receptores muscarínicos. Um total de nove agonista curvas concentração-resposta foram medidos. O experimento pode ser dividido em duas partes. Para cada parte, o agonista padrão (oxotremorinEM) é sempre testado em conjunto com agonistas adicionais. Assim, dois experimentos do tipo mostrado em a e b são obrigados a medir as curvas de concentração-resposta de nove agonistas se apenas cinco agonistas podem ser analisadas de uma só vez. Os dados são da Ehlert et al. 12. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de curvas concentração-resposta para a estimulação de [3 H] acumulação inositolphosphate por vários agonistas muscarínicos em HEK 293 células que expressam o receptor M 2 humana muscarínicos e G α15. Expressão do receptor 2 M causou um 30-35% [3 H] inositolphosphate resposta, que foi atribuída a atividade do receptor constitutivo. Os dados são da Ehlert et al. 12. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig5.jpg" /> Figura 5. </strong&gt; muscarínicos agonista hidrólise mediada fosfatidilinositol em células de ovário de hamster chinês expressando estavelmente o ser humano M 3 receptores muscarínicos. As curvas de concentração-resposta de agonistas muscarínicos selecionados para a hidrólise fosfatidilinositol estimulando são mostrados. Os valores médios de três experimentos ± SEM são mostrados. Os dados são da Ehlert et al. 12. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig6.jpg" /> Figura 6. Oxotremorine-M e McN-A-343-hidrólise mediada fosfatidilinositol em HEK 293 células que expressam G α15 eo receptor muscarínico M 3. Hidrólise fosfatidilinositol é expressa em relação ao máximo de E oxotremorine-M. Na ausência de agonista, a hidrólise fosfatidilinositol atribuída a expressão do receptor 3 M representaram aproximadamente 2% da resposta. O meio de três experimentos ± SEM são mostrados. O data são de Ehlert et al. 3.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Porque o nosso método para estimar RA i (em relação K valor b) só exige a medição de agonista curvas concentração-resposta, a nossa análise pode ser feito a qualquer hora dessas curvas são medidos. Se o dia-a-dia variação na resposta da preparação experimental (por exemplo, células ou tecidos) é grande, as medidas de resposta de cada curva de concentração-resposta pode ser normalizada em relação à estimativa de &quot;Top&quot; do a...

quantifying agonist activity at g protein-coupled receptors

Quando um agonista ativa uma população de G receptores acoplados à proteína (GPCRs), ele provoca uma via de sinalização que culmina na resposta da célula ou tecido. Este processo pode ser analisado a nível de um único receptor, uma população de receptores, ou uma resposta a jusante. Aqui nós descrevemos como analisar a resposta a jusante para obter uma estimativa da afinidade agonista constante para o estado ativo de receptores único. Receptores se comportam como chaves quântica que se alternam entre os estados ativo e inativo (Figura 1). O estado ativo interage com as proteínas G específicas ou outros parceiros de sinalização. Na ausência de ligantes, o estado inativo predomina. A ligação do agonista aumenta a probabilidade de que o receptor muda para o estado ativo porque sua afinidade constante para o estado ativo (K b) é muito maior do que para o estado inativo (K a). A soma dossaídas aleatória de todos os receptores da população gera um nível constante de ativação do receptor no tempo. O inverso da concentração de agonista provocando meio máxima ativação do receptor é equivalente ao constante de afinidade observada (obs K), ea fração de agonista do receptor-complexos no estado ativo é definido como a eficácia (ε) (Figura 2). Métodos para analisar as respostas a jusante de GPCRs foram desenvolvidos que permitem a estimativa do K obs e eficácia relativa de um agonista de 1,2. Neste relatório, vamos mostrar como modificar essa análise para estimar o valor de K agonista b em relação à de outro agonista. No caso de ensaios que exibem atividade constitutiva, mostramos como estimar K b em unidades absolutas de M -1. Nosso método de análise agonista curvas concentração-resposta consiste 3,4de regressão não-linear global usando o modelo operacional 5. Nós descrevemos um procedimento usando o aplicativo de software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). A análise fornece uma estimativa do produto da K obs e um parâmetro proporcional à eficácia (τ). A estimativa de τK obs de um agonista, dividido pelo de outra, é uma medida relativa de K b (RA i) 6. Para qualquer receptor exibindo atividade constitutiva, é possível estimar um parâmetro proporcional à eficácia do complexo receptor livre (τ sys). Neste caso, o valor de K b de um agonista é equivalente a τK obs / τ sys 3. Nosso método é útil para determinar a seletividade de um agonista de subtipos do receptor e para a quantificação agonista do receptor de sinalização através de diferentes proteínas G.

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Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Um método para estimar a afinidade constante de um agonista para o estado ativo (<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt;) De um receptor acoplado à proteína G é descrito. A análise prevê medidas absoluta ou relativa de<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt; Dependendo se a ativação do receptor constitutivo é mensurável. Nosso método aplica-se a jusante várias respostas de ativação do receptor.

Quantificar atividade agonista no G receptores acoplados à proteína

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

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18.2K visualizações.  University of California, Irvine. Um método para estimar a afinidade constante de um agonista para o estado ativo ( K B

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Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Liberação de dopamina no Individual Terminais Pré-Sinápticas visualizado com FFNs

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Biologia

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

Análise comparativa da hormona de crescimento humano no soro utilizando SPRI, Nano-SPRI e ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Quantificar atividade agonista no G receptores acoplados à proteína

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