Gostaríamos de agradecer a Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui por suas contribuições substanciais para o desenvolvimento precoce deste protocolo. Os autores são gratos à comunidade de moscas por sua generosidade com reagentes, e particularmente a Ruth Lehmann e Benjamin Lin por seu dom da linha no5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' antes de sua publicação. Foram utilizados no estudo os estoques obtidos no Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Este trabalho foi apoiado pelo NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D), bem como bolsas de treinamento T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).

1. Preparação do dia-anterior à dissecação
<ol><li>Afie eletróticamente uma agulha de tungstênio24 para que o diâmetro resultante seja de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste a tensão fornecida a aproximadamente 14 V e use 3,3 M NaOH. A nitidez não deve levar mais do que 1 ou 2 min. ATENÇÃO: O NaOH é altamente corrosivo e causará queimaduras após o contato com a pele. Use luvas e óculos durante o manuseio, e trabalhe dentro de um capô de fumaça. NOTA: Após o uso, armazene NaOH em um tubo Falcon de polipropileno.</li>
	<li>Faça a mídia de imagem preparada. Em um tubo cônico de 15 mL, combine 4,25 mL da mídia de Schneider com 750 μL de Soro Bovino Fetal (FBS, 15% de concentração final) e 27,5 μL de penicilina-estreptomicina (0,05 U/μL de Penicilina, 0,05 μg/μL de concentração final). Armazene esta mídia de imagem preparada a 4 °C.</li>
	<li>Faça solução de cola de heptano. Adicione cerca de 0,5 mL de heptano a um frasco vedado de 20 mL recheado com cerca de 20 cm de fita dupla face. Arrase em um nutador por cerca de uma hora, ou mexa com uma ponta de pipeta até que se alcance uma consistência entre a água e o glicerol. Esta solução de cola dissolvida durará vários dias antes que o heptano evapore. Para refrescar a solução, adicione um heptano adicional de 0,5 mL e rocha. NOTA: Uma solução eficaz de heptano-cola pode ser preparada usando várias proporções de heptano para fita, bem como diferentes durações de balanço/agitação. As especificações acima são apenas sugestões para preparar ou refrescar uma solução tão adequada.</li>
</ol>2. Coleta de embriões — 15-17 h antes da dissecação
<ol><li>Adicione pasta de levedura fresca a um prato de ágar de suco de maçã25. Configure uma gaiola de coleta de embriões adicionando moscas adultas (com menos de 10 dias de idade) a uma garrafa de comida vazia, perfurada com pequenos buracos26. Tampe a gaiola de coleta usando a placa de ágar leveasted, colada na garrafa, e coloque a gaiola com o lado da placa para baixo em uma incubadora escura de 25 °C por 1h. NOTA: As moscas devem expressar um transgene que marcará fluorescentemente a gônada, por exemplo, seis eGFP::Moesin20, porque a dissecção dos embriões ocorrerá sob um microscópio estéreo-fluorescente. Consulte Tabela de Materiais para obter uma lista de genótipos usados para marcar a gônego.</li>
	<li>Retire a gaiola da incubadora e descarte esta primeira coleção. Substitua-o por uma placa de ágar recém-leveasted e coloque a gaiola de volta na incubadora por 2h. NOTA: A primeira coleção de embriões é usada para limpar fêmeas de embriões fertilizados e em desenvolvimento, para alcançar uma segunda coleção de embriões bem cronometrados.</li>
	<li>Retire a placa de ágar da gaiola e coloque-a (com o lado levemente voltado para cima) em uma toalha de papel úmida dentro de um recipiente de plástico vedado. Coloque esta câmara úmida em uma incubadora de 25 °C para envelhecer os embriões por 14,5 h (idades finais, 14,5-16,5 h após a colocação do ovo). NOTA: Imediatamente antes do início da etapa 2.4, complete as etapas 3.1 e 3.2.</li>
	<li>Retire a placa de ágar da incubadora e, usando uma garrafa de esguicho, adicione água suficiente à placa de ágar para dissolver a pasta de levedura escovando levemente com um pincel. Enxágüe os embriões e levedura dissolvida em uma pequena cesta de tela de malha sentada dentro de um barco de pesagem. Enxágüe a cesta com a garrafa de esguicho de água até que a maioria da pasta de levedura tenha filtrado através da malha.</li>
	<li>Retire a água do barco de pesagem e coloque a cesta de volta dentro. Descoro os embriões imergindo-os em uma solução de alvejante de 50%, usando uma garrafa de esguicho. A solução de alvejante deve ter uma profundidade de 3-5 mm. Mantenha os embriões submersos em alvejante por ~2 min, com redemoinhos ocasionais. ATENÇÃO: Alvejante é corrosivo e pode irritar ou danificar os olhos e o trato respiratório. Use luvas e óculos enquanto manuseia alvejante. NOTA: Durante este tempo, complete o máximo possível da etapa 3.3. O progresso da descorção pode ser verificado colocando a cesta sob um microscópio estéreo e verificando a ausência dos apêndices dorsais. Submergir os embriões na solução de alvejante por mais tempo, se necessário.</li>
	<li>Descarte o alvejante e enxágue bem os embriões dentro da cesta com água de uma garrafa de esguicho (por ~3 s, manchando a cesta de malha com toalhas de papel; repita 2-3 vezes).</li>
</ol>3. Preparação do dia da dissecação
<ol><li>Adicione 30 μL de insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL de mídia de imagem preparada (ver passo 1.2) em um tubo Eppendorf de 1,5 mL (concentração final de 0,2 mg/mL). Misture bem e deixe o tubo no banco para equilibrar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare as tiras de deslizamento revestidas com cola.<ol>
<li>Use uma faca com ponta de diamante para cortar uma tampa de 22 mm x 22 mm em quatro tiras de tamanho igual (Figura 1A).</li>
		<li>Use fórceps para pegar uma tira e espalhar um total de aproximadamente 30 μL de solução de cola de heptano em ambos os lados da tira (Figura 1B). Para obter uma camada uniforme de resíduo de cola, incline a tira em vários ângulos enquanto o heptano evapora.</li>
		<li>Armazene a tira coberta de cola em um entalhe vazio de uma caixa de deslizamento de tampas; para manter sua pegajosa, coloque a tira em uma posição inclinada, mas vertical, encostada nas bordas da caixa para minimizar o contato com superfícies da caixa (Figura 1C). Feche a caixa para que as partículas no ar não vestem a cola e diminuam sua pegajosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os seguintes itens na bancada: uma pipeta Pasteur de vidro de 6 polegadas, um slide de microscópio, um P200 e um pipeteiro P1000 com as pontas de pipeta apropriadas, a soluçãoringer 27 (pH ajustada a 7,3 com NaOH) e um prato de imagem de 35 mm revestido de Poli-D-Lysine.</li>
	<li>Transfira embriões da cesta de tela de malha para um pequeno vidro de relógio cheio de heptano de 500 a 750 μL.<ol>
<li>Borrihe as laterais e o fundo da cesta secos com uma limpeza de tecido. Umedeça um pincel no heptano, toque o pincel nos embriões (a membrana de vitellina hidrofóbica deve aderir às cerdas), e mergulhe o pincel de volta no heptano no vidro do relógio (embriões devem afundar até o fundo). NOTA: Os próximos passos devem ser realizados o mais rápido possível para evitar que os embriões sequem. Embriões não devem ser expostos ao ar por mais de 20 anos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira os embriões para o slide do microscópio usando uma pipeta Pasteur (Figura 1D). Desenhe embriões na pipeta lentamente e limite-os à porção estreita da pipeta. Embriões pipetas no slide lentamente, de tal forma que eles se agregam apenas dentro da ponta da pipeta antes de fluir para o slide. Torça o canto de uma limpeza de tecido em uma ponta fina, e afaste o heptano dos embriões na lâmina. Eles agregarão e cobrirão uma área menor, facilitando a captura deles em uma tira coberta de cola na próxima etapa.</li>
	<li>Com fórceps, pegue uma tira coberta de cola e toque suavemente nos embriões (Figura 1E). Coloque a tira no prato de imagem, embrião lado para cima, e fora do centro revestido de Poli-D-Lysine. Pressione a tira sobre o prato usando fórceps, para garantir que ela esteja fixada no lugar. Inundar imediatamente o prato com solução ringer de 2-3,5 mL; submergir os embriões primeiro para evitar que eles sequem (Figura 1F).</li>
</ol>4. Dissecção
NOTA: Estas etapas devem ser realizadas sob um microscópio estéreo-fluorescente.
<ol><li>Devitellinize 10-15 embriões. NOTA: Isso pode variar de dois embriões, para iniciantes, até quinze embriões, para especialistas.<ol>
<li>Selecione os embriões do Estágio 16 com base na morfologia intestinal (Figura 2). Nesta fase, os embriões possuem três constrições intestinais que criam quatro segmentos intestinais empilhados (Figura 2B,B'). Para iniciar a devitellinização, fure o embrião selecionado em uma extremidade, de preferência o anterior, com a agulha de tungstênio. O embrião pode sair de sua membrana vitelline, mas se não, retire a membrana do embrião. NOTA: Embriões muito jovens para dissecar têm tripas não regionalizadas (Figura 2C). A dissecção dos embriões estágio 17 é possível, mas mais desafiadora do que a dissecção dos embriões estágio 16 porque a cutícula está começando a se desenvolver nesta fase. Os embriões do Estágio Inicial 17 apresentam quatro segmentos intestinais que são deslocados em relação um ao outro (Figura 2D,D').</li>
		<li>Enganchar a agulha através do embrião em uma região longe das gôndas. Transfira o embrião fisgado para a região revestida de poli-lise do prato (a partir de agora referido como simplesmente "deslizamento de cobertura") e arraste-o contra o fundo até que ele adere. Repita esses passos e organize embriões devitellinizados em uma fileira ao longo do topo do deslizamento de cobertura revestido de poli-lise (Figura 3A), deixando muito espaço abaixo para dissecção posterior. NOTA: As gônadas aparecem como pequenos agregados esféricos de células que devem fluoretar brilhantemente, dependendo do marcador específico usado e do número da cópia transgênica. Nesta fase, as gônadas estão localizadas lateralmente no segmento A5, a aproximadamente 70%-80% do comprimento do embrião do anterior. Durante todo o protocolo de dissecação, o tecido pode grudar na agulha. Para livrar a agulha dos detritos, elevá-la logo acima da superfície da solução do Ringer. A devitellinização pode ser desarrumada desde que a gônada adequada seja perturbada o mínimo possível.</li>
	</ol></li>
	<li>Finesse as gônnas para fora do embrião e para o prato (Figura 3C,D).<ol>
<li>Primeiro, filé do embrião para expor seu interior (Figura 3C). Corte o embrião do centro, movendo a agulha posteriormente, entre as gôndas. Provoque algum tecido interno, pois isso vai grudar no prato muito melhor do que a cutícula externa. A pegajosa do tecido permitirá que as próximas manipulações revelem a gônda e permitam que ela adere ao deslizamento da tampa. NOTA: Se o tecido não estiver grudado no prato, tente persuadi-lo a uma região não contaminada do deslizamento de cobertura revestido; as regiões externas do deslizamento de cobertura serão particularmente pegajosas. Como dito na etapa 4.1.2, não importa se as manipulações de dissecção resultam em uma carcaça de embrião mutilada, desde que as gônadas permaneçam ilesas.</li>
		<li>Use a agulha para cortar em torno de uma gônada até que um pedaço de tecido, incluindo a gônada, seja separado da carcaça restante. Com a agulha, desenhe este tecido para uma região fresca de deslizamento de cobertura revestido, e persuada-o contra o fundo até que ele adere ao prato. NOTA: A melhor imagem será obtida para os casos em que a gônus se prende diretamente ao deslizamento da tampa, em vez de fixação indireta através de tecido sobrelado. Portanto, como o tecido é guiado para longe da carcaça, tente fazer com que a gônada toque primeiro na tampa, em vez de tecido ínteo.</li>
		<li>Remova o máximo possível de tecido circundante da gônada (Figura 3D) arrastando suavemente tecido aderente para longe da gônada com a agulha. Evite tocar diretamente na gônda, o que a danificaria (Figura 4E). Para garantir que a gônada esteja suficientemente aderida ao prato, mova a agulha em um movimento circular suave ao redor da gônada — se ela se mover, toque a agulha no tecido aderente restante e direcione a gônada em direção a uma região fresca de deslizamento de cobertura pegajosa. Repita este processo até que não haja movimento detectável da gônus.</li>
		<li>Volte para a carcaça do embrião e disseca a segunda gônada. Repita este processo no maior número possível de embriões, mas NÃO exceda 25 min. A viabilidade tecidual será comprometida na solução de Ringer após mais de ~40-45 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a conclusão das dissecções, use um marcador indelével para adicionar marcas de registro à borda externa da placa de imagem para registrar sua orientação durante a dissecção.</li>
	<li>Retire a tira revestida de cola do prato.<ol>
<li>Insira suavemente o pino inferior de um par de fórceps sob a tira, fecho e lentamente incline a tira para cima para libertá-la do prato com o menor sloshing da solução do Ringer possível para minimizar a perturbação das gôndas aderidas. NOTA: A tira deve ser inclinada para longe das gônadas dissecadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Leve suavemente o prato para o microscópio de imagem de uma maneira que evite a inclinação da solução do Ringer.</li>
</ol>5. Imagem
<ol><li>Coloque o prato de imagem no suporte do palco, utilizando as marcas de inscrição para colocar o prato na orientação aproximada como durante a dissecção. Usando microscopia de campo brilhante e um objetivo de baixa potência (~10x), identifique e coloque em foco qualquer pedaço de tecido que seja aderido ao deslizamento da tampa. Alterne as configurações da ocular para revelar fluorescência, e usando as oculares binóculos, digitalize sistematicamente o prato, marcando a posição de cada gônada dentro do software de imagem (ver Tabela de Materiais). NOTA: Certifique-se de que as gônadas estão centradas no campo de visão antes de marcar posições.</li>
	<li>Retire suavemente toda a montagem do suporte do palco, com o prato de imagem em seu suporte, e coloque a montagem na bancada de trabalho.</li>
	<li>Substitua a solução do Ringer pela mídia de imagem preparada contendo insulina (ver passos 1.2 e 3.1).<ol>
<li>Use um P1000 para remover toda a solução de Ringer da borda superior interna do prato de imagem (não pipete Ringer's da região central de deslizamento de cobertura). Em seguida, mude para um P200, e coloque sua ponta logo abaixo da superfície do Ringer restante na região central. Remova cuidadosamente 50-100 μL de Ringer;; NÃO remova toda a solução.</li>
		<li>Elasenhe ~200 μL de mídia de imagem e, novamente colocando a ponta P200 logo abaixo da superfície do Ringer restante, adicione lentamente esta mídia de imagem. Em seguida, adicione a mídia de imagem restante (~1.300 μL) ao prato, começando na borda mais externa da borda superior. Enquanto pipeta, mova-se em direção à cúpula central do fluido, e eventualmente mescle os dois escovando a ponta da pipeta através de ambos. Coloque a tampa no prato. NOTA: A mídia de imagem deve cobrir todo o diâmetro interno do prato, com uma profundidade de cerca de 2 mm, para evitar a evaporação (Figura 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mude o microscópio para um objetivo de maior potência (63x, 1.2 NA), aplique o fluido de imersão adequado com base no objetivo utilizado (tipo de fluido de imersão e índice de refração exigido pelo objetivo) e, em seguida, substitua o conjunto do suporte de palco. Use microscopia brightfield para se concentrar no tecido aderido à parte inferior da placa de imagem. NOTA: Se a etapa não foi movida, a última gôndama deve ser vista assim que o objetivo estiver focado.</li>
	<li>Passe por cada posição de gôngeia marcada e ajuste essa posição, conforme necessário. Selecione quais gôndas à imagem com base na clareza de imagem, sexo gôndado, etc. Personalize as configurações de imagem (multicanal, tempos de exposição, intensidades de laser, incrementos da série Z, lapso de tempo com intervalos apropriados, etc.). Comece a imagem. NOTA: As gôngas masculinas podem ser identificadas pela presença de um nicho, e na extremidade oposta da gônada, um aglomerado de pequenas células somáticas altamente circulares chamadas precursores gândalos somáticos específicos do sexo masculino (msSGPs). Se o marcador fluorescente de seis eGFP::moesin for usado, as células de nicho são as segundas células mais brilhantes na gônada, sendo a mais brilhante os msSGPs. Nesta fase, as gôndas femininas não têm um nicho nem msSGPs.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome.">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li><li>Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-Cadherin+is+required+for+centrosome+and+spindle+orientation+in+Drosophila+male+germline+stem+cells.">E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells.</a> PLoS One. 5, 1-7 (2010).</li><li>Lenhart, K. F., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+encystment+promotes+abscission+in+germline+stem+cells+following+a+regulated+block+in+cytokinesis.">Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis.</a> Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).</li><li>Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Germinal+Proliferation+Center+in+the+Testis+of+Drosophila+melanogaster.">The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+group+of+pumilio+mutations+affects+the+asymmetric+division+of+germline+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 124, 2463-2476 (1997).</li><li>Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+piRNA+pathway+is+developmentally+regulated+during+spermatogenesis+in+Drosophila.">The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila.</a> RNA. 22, 1044-1054 (2016).</li><li>Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+to+adult:+PiRNA-mediated+silencing+throughout+germline+development+in+Drosophila.">From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).</li><li>Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., P&#233;rez-Palencia, R., B&#246;kel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+BMP+receptor+activation+at+adherens+junctions+in+the+Drosophila+germline+stem+cell+niche.">Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche.</a> Nature Communications. 2, (2011).</li><li>Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes+mediate+niche-stem-cell+signalling+in+the+Drosophila+testis.">Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis.</a> Nature. 523, 329-332 (2015).</li><li>Leatherman, J. L., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfh-1+controls+somatic+stem+cell+self-renewal+in+the+Drosophila+testis+and+nonautonomously+influences+germline+stem+cell+self-renewal.">Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal.</a> Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).</li><li>Leatherman, J. L., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+self-renewal+requires+cyst+stem+cells,+while+stat+regulates+niche+adhesion+in+Drosophila+testes.">Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes.</a> Nature Cell Biology. 12, (2010).</li><li>Tulina, N., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stem+cell+self-renewal+in+Drosophila+Spermatogenesis+by+JAK-STAT+signaling.">Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling.</a> Science. 294, 2546-2549 (2001).</li><li>Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+spermatogenesis+in+Drosophila+with+P-element+enhancer+detectors.">Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors.</a> Development. 114, 89-98 (1992).</li><li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila.">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+drosophila+testis.">Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).</li><li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche.">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).</li><li>Rebecca Sheng, X., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Aboim, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developpement+embryonnaire+et+post-embryonnaire+des+gonades+normales+et+agametiques+de+Drosophila+melanogaster.">Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster.</a> Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).</li><li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+actin+regulator+ENABLED+regulates+cell+shape+and+orientation+during+gonad+morphogenesis.">The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li><li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis.">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li><li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche.">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Durante a gonadogênese, a gônada embrionária, e particularmente o nicho de células-tronco dentro da gônada masculina15, sofre rápidas alterações morfológicas. Mecanismos de desenvolvimento que fundamentam essas mudanças dinâmicas são melhor compreendidos através de técnicas de imagem ao vivo. No entanto, no estágio 17 embrionário, a imagem in vivo da gônada torna-se impossível pelo início das contrações musculares em larga escala17. Com este pr...

O teste de melanogaster Drosophila tem servido de paradigma para nossa compreensão de muitos processos celulares dinâmicos. Estudos desse modelo lançaram luz sobre a regulação da divisão de células-tronco 1,2,3, desenvolvimento de células germinativas 4,5, biologia piRNA 6,7,8 e eventos de sinalização de células-tronco de nicho 9,10,11,12,13. Este modelo é vantajoso porque é geneticamente tratável14,15 e é um dos poucos onde podemos viver células-tronco em seu ambiente natural 3,16,17,18. No entanto, a imagem viva deste modelo tem sido limitada ao tecido adulto e aos estágios embrionários iniciais, deixando uma lacuna em nosso conhecimento da dinâmica gonadal no embrião tardio, o estágio preciso quando o nicho está se formando e começando a funcionar.
A gônada embrionária em estágio tardio é uma esfera, consistindo de células de nicho somáticas no anterior, e células germinativas enciontadas por células gândalos somáticas em todas as regiões mais posteriores19. Este órgão pode ser retratado ao vivo até o início do estágio 17 17,20,21. Novas imagens são evitadas devido ao início de contrações musculares em larga escala. Essas contrações são tão severas que empurram a gônada para fora do quadro de imagem, e tal movimento não pode ser corrigido com software de imagem. Nosso laboratório está interessado em desvendar os mecanismos de formação de nicho, que ocorre durante esse período indescritível para imagens ao vivo. Por isso, geramos uma abordagem ex vivo para imagem viva da gônada a partir do Estágio 16 embrionário, facilitando o estudo da dinâmica celular durante esse período crucial de desenvolvimento da gônada. Trabalhos anteriores do nosso laboratório mostram que essa imagem ex vivo recapitula fielmente o desenvolvimento da gônsia vivo 17. Esta técnica é a primeira e única do seu tipo para a gônus embrionária Drosophila.
Aqui, apresentamos o protocolo de dissecção necessário para ex vivo live-imaging da gônada durante estágios embrionários tardios. Este protocolo pode ser combinado com tratamentos farmacológicos, ou manipulação transgênica de linhagens celulares específicas dentro da gônada. Usando essa técnica, temos imagens com sucesso dos passos da formação do nicho de células-tronco17. Essa abordagem de imagem é, portanto, fundamental para o campo da biologia das células-tronco, pois permitirá a visualização dos estágios iniciais de formação de nicho em tempo real dentro de seu ambiente natural15,17. Embora este método seja benéfico para o campo da biologia das células-tronco, é adicionalmente aplicável para visualizar quaisquer processos dinâmicos que ocorram na gônada durante este ponto de tempo de desenvolvimento, incluindo rearranjos celulares22, adesão celular 2,12,23 e migração celular23. Esse protocolo de dissecção aumentará assim nossa compreensão de muitos processos biológicos celulares fundamentais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar&#160;Tungsten wire</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA10408G6</td>
			<td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: His2Av::mRFP1</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>FBtp0056035</td>
			<td>Schuh, Lehner, &#38; Heidmann, Current Biology, 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato</td>
			<td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td>
			<td></td>
			<td>Lin, Luo, &#38; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#39;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin</td>
			<td></td>
			<td>FBtp0083398</td>
			<td>Sano et al., PLoS One, 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l0516</td>
			<td>Store aliquots at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nytex basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&#8217;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

A gônada embrionária masculina Drosophila melanogaster é um modelo vantajoso para estudar vários aspectos da biologia do desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de células germinativas, biologia piRNA e formação de nicho. Aqui, apresentamos uma técnica de dissecção ao vivo da gônada ex vivo durante um período em que a imagem ao vivo in vivo é altamente ineficaz. Este protocolo descreve como transferir embriões para um prato de imagem, escolher embriões masculinos adequadamente encenados e dissecar a gônada de seu tecido circundante, mantendo sua integridade estrutural. Após a dissecção, as gôngas podem ser imagens usando um microscópio confocal para visualizar processos celulares dinâmicos. O procedimento de dissecção requer tempo e destreza precisos, mas fornecemos informações sobre como prevenir erros comuns e como superar esses desafios. Pelo que sabemos, este é o primeiro protocolo de dissecção para a gônada embrionária Drosophila , e permitirá imagens vivas durante uma janela de tempo inacessível. Esta técnica pode ser combinada com manipulações transgênicas específicas do tipo farmacológico ou celular para estudar quaisquer processos dinâmicos que ocorram dentro ou entre as células em seu ambiente gonadal natural.

Ilustramos a preparação do prato de imagem na Figura 1, como descrito na "preparação do dia da dissecação". Esses métodos devem, em última análise, resultar em embriões bem hidratados aderidos a uma tira de deslizamento de cobertura, que é temporariamente fixada na parte inferior do prato e submersa na solução de Ringer (Figura 1F). Uma faca de ponta de diamante permite que se corte limpamente uma tampa de 22 x 22 mm em três a quatro tiras menores ...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad at JoVE.com

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.1K visualizações.  University of Pennsylvania. Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Vídeo: Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Biologia do Desenvolvimento

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...