Name: dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad
Uploaded: 2020-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui por suas contribuições substanciais para o desenvolvimento precoce deste protocolo. Os autores são gratos à comunidade de moscas por sua generosidade com reagentes, e particularmente a Ruth Lehmann e Benjamin Lin por seu dom da linha no5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' antes de sua publicação. Foram utilizados no estudo os estoques obtidos no Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Este trabalho foi apoiado pelo NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D), bem como bolsas de treinamento T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).

1. Preparação do dia-anterior à dissecação
<ol><li>Afie eletróticamente uma agulha de tungstênio24 para que o diâmetro resultante seja de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste a tensão fornecida a aproximadamente 14 V e use 3,3 M NaOH. A nitidez não deve levar mais do que 1 ou 2 min. ATENÇÃO: O NaOH é altamente corrosivo e causará queimaduras após o contato com a pele. Use luvas e óculos durante o manuseio, e trabalhe dentro de um capô de fumaça. NOTA: Após o uso, armazene NaOH em um tubo Falcon de polipropileno.</li>
	<li>Faça a mídia de imagem preparada. Em um tubo cônico de 15 mL, combine 4,25 mL da mídia de Schneider com 750 μL de Soro Bovino Fetal (FBS, 15% de concentração final) e 27,5 μL de penicilina-estreptomicina (0,05 U/μL de Penicilina, 0,05 μg/μL de concentração final). Armazene esta mídia de imagem preparada a 4 °C.</li>
	<li>Faça solução de cola de heptano. Adicione cerca de 0,5 mL de heptano a um frasco vedado de 20 mL recheado com cerca de 20 cm de fita dupla face. Arrase em um nutador por cerca de uma hora, ou mexa com uma ponta de pipeta até que se alcance uma consistência entre a água e o glicerol. Esta solução de cola dissolvida durará vários dias antes que o heptano evapore. Para refrescar a solução, adicione um heptano adicional de 0,5 mL e rocha. NOTA: Uma solução eficaz de heptano-cola pode ser preparada usando várias proporções de heptano para fita, bem como diferentes durações de balanço/agitação. As especificações acima são apenas sugestões para preparar ou refrescar uma solução tão adequada.</li>
</ol>2. Coleta de embriões — 15-17 h antes da dissecação
<ol><li>Adicione pasta de levedura fresca a um prato de ágar de suco de maçã25. Configure uma gaiola de coleta de embriões adicionando moscas adultas (com menos de 10 dias de idade) a uma garrafa de comida vazia, perfurada com pequenos buracos26. Tampe a gaiola de coleta usando a placa de ágar leveasted, colada na garrafa, e coloque a gaiola com o lado da placa para baixo em uma incubadora escura de 25 °C por 1h. NOTA: As moscas devem expressar um transgene que marcará fluorescentemente a gônada, por exemplo, seis eGFP::Moesin20, porque a dissecção dos embriões ocorrerá sob um microscópio estéreo-fluorescente. Consulte Tabela de Materiais para obter uma lista de genótipos usados para marcar a gônego.</li>
	<li>Retire a gaiola da incubadora e descarte esta primeira coleção. Substitua-o por uma placa de ágar recém-leveasted e coloque a gaiola de volta na incubadora por 2h. NOTA: A primeira coleção de embriões é usada para limpar fêmeas de embriões fertilizados e em desenvolvimento, para alcançar uma segunda coleção de embriões bem cronometrados.</li>
	<li>Retire a placa de ágar da gaiola e coloque-a (com o lado levemente voltado para cima) em uma toalha de papel úmida dentro de um recipiente de plástico vedado. Coloque esta câmara úmida em uma incubadora de 25 °C para envelhecer os embriões por 14,5 h (idades finais, 14,5-16,5 h após a colocação do ovo). NOTA: Imediatamente antes do início da etapa 2.4, complete as etapas 3.1 e 3.2.</li>
	<li>Retire a placa de ágar da incubadora e, usando uma garrafa de esguicho, adicione água suficiente à placa de ágar para dissolver a pasta de levedura escovando levemente com um pincel. Enxágüe os embriões e levedura dissolvida em uma pequena cesta de tela de malha sentada dentro de um barco de pesagem. Enxágüe a cesta com a garrafa de esguicho de água até que a maioria da pasta de levedura tenha filtrado através da malha.</li>
	<li>Retire a água do barco de pesagem e coloque a cesta de volta dentro. Descoro os embriões imergindo-os em uma solução de alvejante de 50%, usando uma garrafa de esguicho. A solução de alvejante deve ter uma profundidade de 3-5 mm. Mantenha os embriões submersos em alvejante por ~2 min, com redemoinhos ocasionais. ATENÇÃO: Alvejante é corrosivo e pode irritar ou danificar os olhos e o trato respiratório. Use luvas e óculos enquanto manuseia alvejante. NOTA: Durante este tempo, complete o máximo possível da etapa 3.3. O progresso da descorção pode ser verificado colocando a cesta sob um microscópio estéreo e verificando a ausência dos apêndices dorsais. Submergir os embriões na solução de alvejante por mais tempo, se necessário.</li>
	<li>Descarte o alvejante e enxágue bem os embriões dentro da cesta com água de uma garrafa de esguicho (por ~3 s, manchando a cesta de malha com toalhas de papel; repita 2-3 vezes).</li>
</ol>3. Preparação do dia da dissecação
<ol><li>Adicione 30 μL de insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL de mídia de imagem preparada (ver passo 1.2) em um tubo Eppendorf de 1,5 mL (concentração final de 0,2 mg/mL). Misture bem e deixe o tubo no banco para equilibrar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare as tiras de deslizamento revestidas com cola.<ol>
<li>Use uma faca com ponta de diamante para cortar uma tampa de 22 mm x 22 mm em quatro tiras de tamanho igual (Figura 1A).</li>
		<li>Use fórceps para pegar uma tira e espalhar um total de aproximadamente 30 μL de solução de cola de heptano em ambos os lados da tira (Figura 1B). Para obter uma camada uniforme de resíduo de cola, incline a tira em vários ângulos enquanto o heptano evapora.</li>
		<li>Armazene a tira coberta de cola em um entalhe vazio de uma caixa de deslizamento de tampas; para manter sua pegajosa, coloque a tira em uma posição inclinada, mas vertical, encostada nas bordas da caixa para minimizar o contato com superfícies da caixa (Figura 1C). Feche a caixa para que as partículas no ar não vestem a cola e diminuam sua pegajosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os seguintes itens na bancada: uma pipeta Pasteur de vidro de 6 polegadas, um slide de microscópio, um P200 e um pipeteiro P1000 com as pontas de pipeta apropriadas, a soluçãoringer 27 (pH ajustada a 7,3 com NaOH) e um prato de imagem de 35 mm revestido de Poli-D-Lysine.</li>
	<li>Transfira embriões da cesta de tela de malha para um pequeno vidro de relógio cheio de heptano de 500 a 750 μL.<ol>
<li>Borrihe as laterais e o fundo da cesta secos com uma limpeza de tecido. Umedeça um pincel no heptano, toque o pincel nos embriões (a membrana de vitellina hidrofóbica deve aderir às cerdas), e mergulhe o pincel de volta no heptano no vidro do relógio (embriões devem afundar até o fundo). NOTA: Os próximos passos devem ser realizados o mais rápido possível para evitar que os embriões sequem. Embriões não devem ser expostos ao ar por mais de 20 anos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira os embriões para o slide do microscópio usando uma pipeta Pasteur (Figura 1D). Desenhe embriões na pipeta lentamente e limite-os à porção estreita da pipeta. Embriões pipetas no slide lentamente, de tal forma que eles se agregam apenas dentro da ponta da pipeta antes de fluir para o slide. Torça o canto de uma limpeza de tecido em uma ponta fina, e afaste o heptano dos embriões na lâmina. Eles agregarão e cobrirão uma área menor, facilitando a captura deles em uma tira coberta de cola na próxima etapa.</li>
	<li>Com fórceps, pegue uma tira coberta de cola e toque suavemente nos embriões (Figura 1E). Coloque a tira no prato de imagem, embrião lado para cima, e fora do centro revestido de Poli-D-Lysine. Pressione a tira sobre o prato usando fórceps, para garantir que ela esteja fixada no lugar. Inundar imediatamente o prato com solução ringer de 2-3,5 mL; submergir os embriões primeiro para evitar que eles sequem (Figura 1F).</li>
</ol>4. Dissecção
NOTA: Estas etapas devem ser realizadas sob um microscópio estéreo-fluorescente.
<ol><li>Devitellinize 10-15 embriões. NOTA: Isso pode variar de dois embriões, para iniciantes, até quinze embriões, para especialistas.<ol>
<li>Selecione os embriões do Estágio 16 com base na morfologia intestinal (Figura 2). Nesta fase, os embriões possuem três constrições intestinais que criam quatro segmentos intestinais empilhados (Figura 2B,B'). Para iniciar a devitellinização, fure o embrião selecionado em uma extremidade, de preferência o anterior, com a agulha de tungstênio. O embrião pode sair de sua membrana vitelline, mas se não, retire a membrana do embrião. NOTA: Embriões muito jovens para dissecar têm tripas não regionalizadas (Figura 2C). A dissecção dos embriões estágio 17 é possível, mas mais desafiadora do que a dissecção dos embriões estágio 16 porque a cutícula está começando a se desenvolver nesta fase. Os embriões do Estágio Inicial 17 apresentam quatro segmentos intestinais que são deslocados em relação um ao outro (Figura 2D,D').</li>
		<li>Enganchar a agulha através do embrião em uma região longe das gôndas. Transfira o embrião fisgado para a região revestida de poli-lise do prato (a partir de agora referido como simplesmente "deslizamento de cobertura") e arraste-o contra o fundo até que ele adere. Repita esses passos e organize embriões devitellinizados em uma fileira ao longo do topo do deslizamento de cobertura revestido de poli-lise (Figura 3A), deixando muito espaço abaixo para dissecção posterior. NOTA: As gônadas aparecem como pequenos agregados esféricos de células que devem fluoretar brilhantemente, dependendo do marcador específico usado e do número da cópia transgênica. Nesta fase, as gônadas estão localizadas lateralmente no segmento A5, a aproximadamente 70%-80% do comprimento do embrião do anterior. Durante todo o protocolo de dissecação, o tecido pode grudar na agulha. Para livrar a agulha dos detritos, elevá-la logo acima da superfície da solução do Ringer. A devitellinização pode ser desarrumada desde que a gônada adequada seja perturbada o mínimo possível.</li>
	</ol></li>
	<li>Finesse as gônnas para fora do embrião e para o prato (Figura 3C,D).<ol>
<li>Primeiro, filé do embrião para expor seu interior (Figura 3C). Corte o embrião do centro, movendo a agulha posteriormente, entre as gôndas. Provoque algum tecido interno, pois isso vai grudar no prato muito melhor do que a cutícula externa. A pegajosa do tecido permitirá que as próximas manipulações revelem a gônda e permitam que ela adere ao deslizamento da tampa. NOTA: Se o tecido não estiver grudado no prato, tente persuadi-lo a uma região não contaminada do deslizamento de cobertura revestido; as regiões externas do deslizamento de cobertura serão particularmente pegajosas. Como dito na etapa 4.1.2, não importa se as manipulações de dissecção resultam em uma carcaça de embrião mutilada, desde que as gônadas permaneçam ilesas.</li>
		<li>Use a agulha para cortar em torno de uma gônada até que um pedaço de tecido, incluindo a gônada, seja separado da carcaça restante. Com a agulha, desenhe este tecido para uma região fresca de deslizamento de cobertura revestido, e persuada-o contra o fundo até que ele adere ao prato. NOTA: A melhor imagem será obtida para os casos em que a gônus se prende diretamente ao deslizamento da tampa, em vez de fixação indireta através de tecido sobrelado. Portanto, como o tecido é guiado para longe da carcaça, tente fazer com que a gônada toque primeiro na tampa, em vez de tecido ínteo.</li>
		<li>Remova o máximo possível de tecido circundante da gônada (Figura 3D) arrastando suavemente tecido aderente para longe da gônada com a agulha. Evite tocar diretamente na gônda, o que a danificaria (Figura 4E). Para garantir que a gônada esteja suficientemente aderida ao prato, mova a agulha em um movimento circular suave ao redor da gônada — se ela se mover, toque a agulha no tecido aderente restante e direcione a gônada em direção a uma região fresca de deslizamento de cobertura pegajosa. Repita este processo até que não haja movimento detectável da gônus.</li>
		<li>Volte para a carcaça do embrião e disseca a segunda gônada. Repita este processo no maior número possível de embriões, mas NÃO exceda 25 min. A viabilidade tecidual será comprometida na solução de Ringer após mais de ~40-45 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a conclusão das dissecções, use um marcador indelével para adicionar marcas de registro à borda externa da placa de imagem para registrar sua orientação durante a dissecção.</li>
	<li>Retire a tira revestida de cola do prato.<ol>
<li>Insira suavemente o pino inferior de um par de fórceps sob a tira, fecho e lentamente incline a tira para cima para libertá-la do prato com o menor sloshing da solução do Ringer possível para minimizar a perturbação das gôndas aderidas. NOTA: A tira deve ser inclinada para longe das gônadas dissecadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Leve suavemente o prato para o microscópio de imagem de uma maneira que evite a inclinação da solução do Ringer.</li>
</ol>5. Imagem
<ol><li>Coloque o prato de imagem no suporte do palco, utilizando as marcas de inscrição para colocar o prato na orientação aproximada como durante a dissecção. Usando microscopia de campo brilhante e um objetivo de baixa potência (~10x), identifique e coloque em foco qualquer pedaço de tecido que seja aderido ao deslizamento da tampa. Alterne as configurações da ocular para revelar fluorescência, e usando as oculares binóculos, digitalize sistematicamente o prato, marcando a posição de cada gônada dentro do software de imagem (ver Tabela de Materiais). NOTA: Certifique-se de que as gônadas estão centradas no campo de visão antes de marcar posições.</li>
	<li>Retire suavemente toda a montagem do suporte do palco, com o prato de imagem em seu suporte, e coloque a montagem na bancada de trabalho.</li>
	<li>Substitua a solução do Ringer pela mídia de imagem preparada contendo insulina (ver passos 1.2 e 3.1).<ol>
<li>Use um P1000 para remover toda a solução de Ringer da borda superior interna do prato de imagem (não pipete Ringer's da região central de deslizamento de cobertura). Em seguida, mude para um P200, e coloque sua ponta logo abaixo da superfície do Ringer restante na região central. Remova cuidadosamente 50-100 μL de Ringer;; NÃO remova toda a solução.</li>
		<li>Elasenhe ~200 μL de mídia de imagem e, novamente colocando a ponta P200 logo abaixo da superfície do Ringer restante, adicione lentamente esta mídia de imagem. Em seguida, adicione a mídia de imagem restante (~1.300 μL) ao prato, começando na borda mais externa da borda superior. Enquanto pipeta, mova-se em direção à cúpula central do fluido, e eventualmente mescle os dois escovando a ponta da pipeta através de ambos. Coloque a tampa no prato. NOTA: A mídia de imagem deve cobrir todo o diâmetro interno do prato, com uma profundidade de cerca de 2 mm, para evitar a evaporação (Figura 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mude o microscópio para um objetivo de maior potência (63x, 1.2 NA), aplique o fluido de imersão adequado com base no objetivo utilizado (tipo de fluido de imersão e índice de refração exigido pelo objetivo) e, em seguida, substitua o conjunto do suporte de palco. Use microscopia brightfield para se concentrar no tecido aderido à parte inferior da placa de imagem. NOTA: Se a etapa não foi movida, a última gôndama deve ser vista assim que o objetivo estiver focado.</li>
	<li>Passe por cada posição de gôngeia marcada e ajuste essa posição, conforme necessário. Selecione quais gôndas à imagem com base na clareza de imagem, sexo gôndado, etc. Personalize as configurações de imagem (multicanal, tempos de exposição, intensidades de laser, incrementos da série Z, lapso de tempo com intervalos apropriados, etc.). Comece a imagem. NOTA: As gôngas masculinas podem ser identificadas pela presença de um nicho, e na extremidade oposta da gônada, um aglomerado de pequenas células somáticas altamente circulares chamadas precursores gândalos somáticos específicos do sexo masculino (msSGPs). Se o marcador fluorescente de seis eGFP::moesin for usado, as células de nicho são as segundas células mais brilhantes na gônada, sendo a mais brilhante os msSGPs. Nesta fase, as gôndas femininas não têm um nicho nem msSGPs.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li><li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis.">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li><li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche.">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Durante a gonadogênese, a gônada embrionária, e particularmente o nicho de células-tronco dentro da gônada masculina15, sofre rápidas alterações morfológicas. Mecanismos de desenvolvimento que fundamentam essas mudanças dinâmicas são melhor compreendidos através de técnicas de imagem ao vivo. No entanto, no estágio 17 embrionário, a imagem in vivo da gônada torna-se impossível pelo início das contrações musculares em larga escala17. Com este pr...

O teste de melanogaster Drosophila tem servido de paradigma para nossa compreensão de muitos processos celulares dinâmicos. Estudos desse modelo lançaram luz sobre a regulação da divisão de células-tronco 1,2,3, desenvolvimento de células germinativas 4,5, biologia piRNA 6,7,8 e eventos de sinalização de células-tronco de nicho 9,10,11,12,13. Este modelo é vantajoso porque é geneticamente tratável14,15 e é um dos poucos onde podemos viver células-tronco em seu ambiente natural 3,16,17,18. No entanto, a imagem viva deste modelo tem sido limitada ao tecido adulto e aos estágios embrionários iniciais, deixando uma lacuna em nosso conhecimento da dinâmica gonadal no embrião tardio, o estágio preciso quando o nicho está se formando e começando a funcionar.
A gônada embrionária em estágio tardio é uma esfera, consistindo de células de nicho somáticas no anterior, e células germinativas enciontadas por células gândalos somáticas em todas as regiões mais posteriores19. Este órgão pode ser retratado ao vivo até o início do estágio 17 17,20,21. Novas imagens são evitadas devido ao início de contrações musculares em larga escala. Essas contrações são tão severas que empurram a gônada para fora do quadro de imagem, e tal movimento não pode ser corrigido com software de imagem. Nosso laboratório está interessado em desvendar os mecanismos de formação de nicho, que ocorre durante esse período indescritível para imagens ao vivo. Por isso, geramos uma abordagem ex vivo para imagem viva da gônada a partir do Estágio 16 embrionário, facilitando o estudo da dinâmica celular durante esse período crucial de desenvolvimento da gônada. Trabalhos anteriores do nosso laboratório mostram que essa imagem ex vivo recapitula fielmente o desenvolvimento da gônsia vivo 17. Esta técnica é a primeira e única do seu tipo para a gônus embrionária Drosophila.
Aqui, apresentamos o protocolo de dissecção necessário para ex vivo live-imaging da gônada durante estágios embrionários tardios. Este protocolo pode ser combinado com tratamentos farmacológicos, ou manipulação transgênica de linhagens celulares específicas dentro da gônada. Usando essa técnica, temos imagens com sucesso dos passos da formação do nicho de células-tronco17. Essa abordagem de imagem é, portanto, fundamental para o campo da biologia das células-tronco, pois permitirá a visualização dos estágios iniciais de formação de nicho em tempo real dentro de seu ambiente natural15,17. Embora este método seja benéfico para o campo da biologia das células-tronco, é adicionalmente aplicável para visualizar quaisquer processos dinâmicos que ocorram na gônada durante este ponto de tempo de desenvolvimento, incluindo rearranjos celulares22, adesão celular 2,12,23 e migração celular23. Esse protocolo de dissecção aumentará assim nossa compreensão de muitos processos biológicos celulares fundamentais.

<table><tbody><tr><td>Alfa Aesar Tungsten wire</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster:&lt;/em&gt; His2Av::mRFP1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>FBtp0056035</td><td>Schuh, Lehner, &amp;amp; Heidmann, Current Biology, 2007</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: nos&lt;/em&gt;-lifeact::tdtomato</td><td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td><td></td><td>Lin, Luo, &amp;amp; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#039;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin&lt;/em&gt;</td><td></td><td>FBtp0083398</td><td>Sano et al., PLoS One, 2012</td></tr><tr><td>Diamond-tipped knife</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Imaging dish</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td></tr><tr><td>Insulin, bovine</td><td>Sigma</td><td>l0516</td><td>Store aliquots at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-955</td><td></td></tr><tr><td>Nytex basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution</td><td></td><td></td><td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&amp;rsquo;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Media</td><td>GIBCO</td><td>21720-024</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

A gônada embrionária masculina Drosophila melanogaster é um modelo vantajoso para estudar vários aspectos da biologia do desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de células germinativas, biologia piRNA e formação de nicho. Aqui, apresentamos uma técnica de dissecção ao vivo da gônada ex vivo durante um período em que a imagem ao vivo in vivo é altamente ineficaz. Este protocolo descreve como transferir embriões para um prato de imagem, escolher embriões masculinos adequadamente encenados e dissecar a gônada de seu tecido circundante, mantendo sua integridade estrutural. Após a dissecção, as gôngas podem ser imagens usando um microscópio confocal para visualizar processos celulares dinâmicos. O procedimento de dissecção requer tempo e destreza precisos, mas fornecemos informações sobre como prevenir erros comuns e como superar esses desafios. Pelo que sabemos, este é o primeiro protocolo de dissecção para a gônada embrionária Drosophila , e permitirá imagens vivas durante uma janela de tempo inacessível. Esta técnica pode ser combinada com manipulações transgênicas específicas do tipo farmacológico ou celular para estudar quaisquer processos dinâmicos que ocorram dentro ou entre as células em seu ambiente gonadal natural.

Ilustramos a preparação do prato de imagem na Figura 1, como descrito na "preparação do dia da dissecação". Esses métodos devem, em última análise, resultar em embriões bem hidratados aderidos a uma tira de deslizamento de cobertura, que é temporariamente fixada na parte inferior do prato e submersa na solução de Ringer (Figura 1F). Uma faca de ponta de diamante permite que se corte limpamente uma tampa de 22 x 22 mm em três a quatro tiras menores ...

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.2K visualizações.  University of Pennsylvania. Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Vídeo: Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Imagem de explantes cerebrais vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor em destaque: Investigando a dinâmica assimétrica da divisão celular: um protocolo para imagens ao vivo de explantes cerebrais de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

Resumo

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Vivo-imaging da

Longo prazo Imagens ao vivo de

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila

Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches