Este trabalho foi financiado pela American Heart Association Scientist Desenvolvimento Grant 0635480N e National Institutes of Health Research Grant AI081220. BIC é apoiado por uma Templar Knights Eye Foundation bolsa de investigação.

Visão global Protocolos são fornecidos para definir primeiro a dosagem do agente mutagénico levando a uma morte 70% dos parasitas (protocolo 1). O procedimento seguinte é fornecido para enriquecer os mutantes egresso induzidas a partir de uma piscina parasita mutagenizada (protocolo 2, Figura 2). Isto é seguido por um protocolo para testar a incidência de mutantes de egresso na piscina enriquecido, ou para validar o fenótipo de saída em mutantes individuais (protocolo 3). Finalmente, um protocolo é fornecida para gerar clones de parasitas individuais a partir de populações enriquecidas por diluição limitante (protocolo 4). 1. Titulação do mutagéneo Tenha cuidado especial, como luvas duplas, ao trabalhar com compostos altamente mutagênicos e líquidos. Coletar o resíduo líquido separadamente para destinação adequada. <ol><li> Inocular frascos de cultura de tecidos T25 confluentes com humanos prepúcio de fibroblastos (HFF) células com 1 ml de taquizoítos de fresco lisadas e crescer 18-25 horas a 37 °; C sob 5% de CO2 em Ed1 médio (D-MEM suplementado com 1% inactivado pelo calor de soro bovino fetal, 0,2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml, e 0,25 ug / ml de anfotericina B ). Veja Roos et al. para o crescimento geral e meios de comunicação das células HFF e parasitas 21. </li><li> Substituir meio com 10 ml de 0,1% médio de soro fetal bovino (diluído 1:10 Ed1 em D-MEM) e deixar em humidificada a 37 ° C incubadora sob CO2 a 5% (chamado &quot;37 ° C incubadora&quot; a partir daqui por diante) durante 10 min . </li><li> Adicionar 0, 12,5, 25, 50 ou 100 ul ENU (1 Banco M em DMSO) ou EMS (1 Banco M em DMSO) por balão (diluições de mutagênico de trabalho vai ser de 1,25, 2,5, 5 e 10 mM, respectivamente). Adicionar DMSO a 100 uL de cada frasco. Incubar durante 4 horas a 37 ° C incubadora. </li><li> Lavar três vezes durante 10 segundos à temperatura ambiente, por lavagem da monocamada com 10 ml de PBS frio (pré-arrefecido a 4 ° C). </li><li> Adicionar 5 ml de PBS, raspar a monocamada solto com um policial de borracha (célula scraper), passar as células raspadas através de uma agulha 26,5 G remover fisicamente o parasita dos fibroblastos (clipe fora do eixo fora da agulha com uma tesoura pesados ​​para não expor a agulha), e filtro com 3,0 mM filtro de policarbonato. Passagens de agulhas múltiplas irá aumentar a eficiência de libertação de parasitas a partir da célula hospedeira. </li><li> Contar a concentração parasita usando um hemocitómetro. Deixe os parasitas resolver durante 5 min na hemocytomer antes da contagem. </li><li> Diluir parasitas a 10.000 parasitas por 3 ml em Ed1 (para 10 ml 33.333 parasitas são necessários). </li><li> Inocular um poço numa placa de 6 poços com 3 ml de os parasitas diluídos (contendo 10.000 parasitas). Serialmente diluir os parasitas de 10 vezes ao longo de 3 poços de uma placa confluente de 6 poços com células HFF contendo 2,7 ml Ed1 pela transferência de 300 uL para fora do primeiro poço. Deixar as placas não perturbadas na incubadora a 37 ° C durante 7 dias. </li><li> Aspirar médio, corrigir 15 min com 3 ml / poço de etanol 100%, manchacom 3 ml / poço solução de violeta de cristal (12,5 g de violeta de cristal em 125 ml de etanol misturado com 500 ml de oxalato de amónio a 1%) durante 15 min, lavar com 3 ml / poço de PBS (1 minuto) e ar seco. Tudo em temperatura ambiente. </li><li> Contar as placas e seleccionar concentração de agente mutagénico necessário para alcançar a sobrevivência de 30% dos parasitas expostos (70% matando dosagem: ver Figura 1). Uma dosagem de matar 70% tem sido utilizada historicamente 14 e induziu menos de 100 mutações pontuais por genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito submetido). </li></ol> 2. Enriquecimento de mutantes saída (Figura 2) <ol><li> Realizar mutagénese tal como descrito acima, usando uma dosagem mutagénica induzir morte de 70%. Crescer a população mutagenizada para uma passagem em um balão de novo de células hospedeiras. </li><li> Infect um T25, HFF frasco de cultura confluente tecido com 120.000 parasitas de fresco lisadas a partir de uma população mutagenizada em 10 ml Ed1. Incubar durante 2 horas em um incubador a 35 ° C sob 5% de CO2 e umidificado (doravante denominada &quot;35 ° C incubadora&quot;). </li><li> Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos com 10 ml PBS frio e, em seguida, adicionam-se 10 ml Ed1 meio suplementado com 25 mg / ml de sulfato de dextrano (DS) 13. Incubar durante 26 horas num incubador a 40 ° C sob 5% de CO2 e humidificado (doravante denominado &quot;40 ° C incubadora&quot;). </li><li> Preparar solução de trabalho de promotores de saída. Diluir o indutor de saída de escolha para a concentração de trabalho em um tubo Falcon 15 ml contendo 10 ml HBSSc suplementado com 25 mg / ml DS. Pré-aquecer as diluições durante 30 min em um banho-maria a 37 ° C. Ver Tabela 1 para as concentrações de trabalho. </li><li> Aspirar médio dos frascos parasita infectadas e adicionar pré-aquecida solução indutor de saída. Incubar no 37 ° C incubadora para os tempos indicados na Tabela 1. </li><li> Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos com 10 ml PBS frio e, em seguida, adicionam-se 10 ml Ed1 suplementado com 25 mg / ml e DS 50 uM pirrolidina ditiocarbamato (PDTC: add uL 5 de 100 mM de Stock PDTC em PBS) 13. Incubar em 5 horas a 35 ° C incubadora. </li><li> Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos, uma vez com 10 ml de PBS (temperatura ambiente) e depois adicionar 10 ml Ed1 médio. Coloque frascos de volta para a 35 ° C até incubadora parasitas destruir a monocamada: frascos de agitação diária. Esta recuperação leva cerca de 7 dias. </li></ol> 3. Validação de fenótipos mutantes por ensaios de ingresso Depois de executar a tela de enriquecimento e crescimento da população enriquecida por uma passagem em células HFF, os fenótipos precisam ser confirmados por um teste de saída 11,13. Este ensaio deve também ser utilizado para validar os clones individuais após o protocolo 4. <ol><li> Inocule 20.000 parasitas por poço numa placa de 24 poços contendo células HFF confluentes cultivadas em lamelas (1 ml Ed1 médio por poço). Incubar 8 horas em um incubador a 35 ° C, em seguida, transferir para um incubador a 40 ° C durante 24 horas. </li><li> Lava-se com 1 ml / poço de PBS (10 segundos à temperatura ambiente). Adicionar 1 ml (indutores de egresso incluem uma DMSO apenas controlo negativo), pré-aquecidos e diluído em HBSSc e incubar durante os tempos descritos na Tabela 1. </li><li> Aspirar médio e fixar com 1 ml / poço metanol a 100% durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Se parasitas pais que expressam uma proteína autofluorescente foram utilizados para a mutagênese, vá para a etapa # 3.5 13. Se parasitas não fluorescentes proteína exprimindo foram utilizados como linha parental, manchar as lamelas fixas com Diff-Quick mancha durante 1 min à temperatura ambiente 11. </li><li> Lavar 5 min com 1 ml / poço de PBS na placa de 24 cavidades, à temperatura ambiente. </li><li> Para parasitas que expressam proteínas fluorescentes: lavar rapidamente a lamela em DDH 2 O (imersão) e montar em lâminas sob gelmount para proteger o sinal de fluorescência. Para Diff-Quick parasitas coradas, lavar 10 segundos em etanol a 100% e deixar secar ao ar antes da montagem no slide. </li><li> Usando um microscópio (fluorescência) com um40-60x objectivo contar a percentagem de vacúolos egresso versus os vacúolos que permaneceram intracelular (ver Figura 4). </li></ol> 4. Clone mutantes egresso por diluição limitante Após a validação do fenótipo da população saída enriquecido mutante usando o protocolo 3, a população policlonal precisa de ser clonado a obtenção de clones de parasitas individuais. <ol><li> Contar população parasita em um hemocitómetro e diluir até uma concentração de 500 parasitas por ml em meio Ed1. </li><li> Em uma placa de 384 poços contendo uma monocamada confluente de células HFF, substituir o meio com 40 uL / ​​poço de Ed1 média usando uma pipeta multi-canal. Como mostrado na Figura 5, quatro populações policlonais podem ser clonadas por placa como se segue: pipeta 40 uL / ​​poço de mutante diluído 1 em poços C3-C12, mutante 2 em poços C13-C22, 3 mutante em poços H3-H12, e mutante 4 em poços H13-H22 (volume final nos poços é agora 80 uL). Usando um multi-canal pipeta pipeta, o solution cima e para baixo 5 vezes, em seguida, transferir 40 ul para a linha abaixo da linha de partida (a partir de linha C para D ou H linha de I). Continuar estas diluições 2-dobragem de série através de linha G (mutantes 1 e 2) ou linha N (mutantes 3 e 4). Descarte a 40 ul extra da última linha. Incubar em 35 ° C incubadora durante 7-10 dias, sem perturbar a placa. </li><li> Verificar as cavidades sobre um microscópio invertido com uma objectiva 10-20x para a presença de placas individuais, visível como dos buracos &#39;na monocamada. </li><li> Escolha 4 poços por mutante com uma única placa e transferir os parasitas em um balão de cultura de tecidos confluentes com células HFF e preenchido com Ed1 médio. Crescer os parasitas em uma incubadora a 35 ° C; agitar os frascos diários para dispersar os parasitas extracelulares. Isso normalmente leva 7 dias. </li></ol> 5. Os resultados representativos A ENU mutagénicos e EMS não são estáveis ​​quando armazenadas durante longos períodos de tempo. Portanto, testando o poder mutagénico doos estoques é crítica para a obtenção de resultados reprodutíveis. Resultados de titulação típicas e matando curvas para ambos ENU e EMS são mostrados na Figura 1. No entanto, é recomendado para realizar ensaios de placa para cada experiência de mutagénese para assegurar que a dosagem apropriada foi usado. Para manter a diversidade da população mutagenizada parasita, é importante para prosseguir com a tela de saída mutante tão rapidamente quanto possível. Tipicamente, uma passagem dos parasitas para um balão de novo é realizada para deixar que os parasitas sobreviventes recuperar antes de ir para a frente com a tela. Deve ser mantido em mente que fazer isso irá resultar em divisão dos mutantes. Portanto, não pode ser excluído que vários mutantes clonais isoladas depois de completar todo o procedimento conter exactamente o mesmo genótipo. Para evitar o isolamento dos mesmos mutantes várias vezes, recomenda-se isolar apenas um mutante egresso único por mutagénese, a menos que seus fenótipos (por exemplo, diferenciais sensibilidades indutor egresso) sãomuito diferentes umas das outras. Por outro lado, nem todos os resultados da tela em isolamento de mutantes com o fenótipo desejado. Em particular, a Ca2 +-ionóforo A23187 fenótipo resistente é rara e requer a realização de mutagénese múltiplas e telas para isolar um mutante de saída única. Portanto, recomenda-se realizar mutagénese 5-10 e as experiências de tela em paralelo. O poder de enriquecimento da tela foi testada por mistura de um mutante de saída conhecido do tipo selvagem com parasitas em diferentes proporções. Estas misturas foram submetidas à tela ea incidência do fenótipo mutante na população enriquecida foi avaliada. Ao utilizar de tipo selvagem parasitas que expressam RFP citoplasmática e uma linha mutante expressando YFP citoplasmática as incidências poderia ser rapidamente estabelecidos por citometria de fluxo (Figura 3) 13. Os resultados mostram que os fenótipos mutantes podem ser rotineiramente enriquecido a pureza de 80%, começando com um parasita saída mutante por 10.000 p de tipo selvagemarasites 13. No entanto, quando a saída mutante: tipo selvagem rácio de início parasita é 1:100.000 parasitas, a população isolado é apenas 1-2% mutantes (1:100) de saída. Por conseguinte, o poder de enriquecimento da tela é 1000 vezes. Uma vez que a tela se inicia com a inoculação de 120.000 parasitas, dos quais tipicamente 70% viáveis, que normalmente executar duas rondas de enriquecimento. Os parasitas isolados são crescido entre as rodadas de enriquecimento. Este procedimento leva a uma população de 100% mutante mesmo quando começando com 1:1.000.000 egresso mutante: tipo selvagem parasitas. O ensaio de saída para validar e caracterizar os fenótipos requer uma multiplicidade de infecção da célula hospedeira que permite a diferenciação de vacúolos individuais. Isto é especialmente crítico ao analisar as condições com altas porcentagens de saída como os parasitas individuais são espalhados. Como mostrado na Figura 4, se as populações egressos não são bem separados é fácil subestimar a percentagemde saída, contando dois vacúolos egressos como um vacúolo. Desde saída e invasão são processos relacionados, e alguns fenótipos sensíveis à temperatura exibir um fenótipo leve à temperatura mais baixa, nem todos os mutantes terá eficiências de invasão semelhantes. Tais mutantes devem, portanto, ser inoculado em várias doses mais elevadas de dobragem para se obter uma densidade vacúolo suficientemente elevada para uma avaliação precisa do seu fenótipo de saída. Além disso, alguns indutores egresso não eficientemente estimular a saída dos vacúolos contendo quatro parasitas ou menos. Como tal, é importante que vacúolos conter oito parasitas ou mais quando iniciar o ensaio de saída. Em nosso laboratório nós mutantes tela isolado com uma determinada saída potenciador contra potenciadores egresso outros. Por seu perfil de reatividade cruzada dos mutantes podem ser agrupados em classes diferentes. Por último, nem todos os mutantes de egresso será sensível à temperatura. Em mutantes particulares isoladas com indutores de ingresso desencadear passos antes do lançamento do intracellular Ca 2 + são propensos a temperatura não-fenótipos sensíveis. Isto é devido às vias paralelas que podem levar a egress antes que o sinal converge sobre a libertação de Ca 2 + intracelular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Figura 1. Chemical titulação dosagem mutagênico. Ensaios de placa A. realizado em uma placa de 6 poços utilizando várias concentrações do SME e vários números de parasitas por poço, como indicado. As manchas brancas são placas de parasitas formadas na monocamada HFF. B, C. As curvas de sobrevivência de parasitas após a exposição a várias dosagens de EMS (B) e ENU (C). A sobrevivência foi avaliada por ensaios de placa. Uma dosagem induzir morte de 70% é escolhido para experiências de mutagénese. Médias de três experimentos independentes + / - desvio padrão são mostrados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Representação esquemática da tela de enriquecimento saída mutante. Temperatura é indicado no eixo y, enquanto que a progressão do tempo é representado pelo eixo x. Parasitas verdes refletir egresso parasitas mutantes, parasitas vermelhos refletem tipo selvagem parasitas. A temporização de alterações nas condições e estimulação pela indutor de saída são indicados na parte superior e são marcadas por setas na linha azul reflectindo o perfil de temperatura. Adoptado a partir Eidell et al. 13. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Figura 3. Enriquecimento típico de egresso fenótipos mutantes. Resultados de enriquecimento de um mutante de saída misturado em tipo selvagem parasitas em várias proporções (eixo X). A percentagem de egresso fenótipos mutantes na população crescido após a tela é traçada no eixo y e foi avaliada por citometria de fluxo (egresso parasitas mutantes expressos YFP citoplasmática, de tipo selvagem parasitas expressa cytoplasmic RFP). Resultados de três experimentos independentes são representados por pontos vermelhos, azuis e verdes. Adoptado a partir Eidell et al. 13. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Figura 4. Os resultados típicos de um ensaio de saída. A Arrows. Marcar quatro diferentes vacúolos contendo parasitas intactos 4-8. B. Setas marcar quatro grupos de parasitas espalhados refletindo quatro independentes vacúolos egressos. Egresso foi induzida por A23187 (B) ou DMSO como um controle negativo (A). Parasitas expressar YFP citoplasmática 22. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Figura 5. Diluição em série para as linhas de parasitas clonal. Quatro populações policlonais (vermelho, azul, amarelo, verde) são diluídos em série em uma única placa confluente 384-bem com células HFF. Linha C e recebo 10 parasitas por poço esão duas vezes diluído (40 uL + 40 uL) até linhas H e N, respectivamente. O tom de cinza indica a diminuição do número de parasitas por bem. Tipicamente, os clones individuais são encontrados em linhas DF e JL. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Estoque </td><td> Concentração de trabalho </td><td> uL necessário para T25 (10 ml) </td><td> O tempo de incubação (min) </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M em DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> 190 Proof </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM em DMSO </td><td> 1 uM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> * nigericina </td><td> 2 mM em DMSO </td><td> 10 uM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericina não pode ser utilizado na enriquecermento tela como os parasitas não sobrevivem estimulação nigericina; usar apenas nigericina na validação de mutantes de ingresso. Indutores Tabela 1. Egresso utilizados em procedimentos. Diluir em 10 ml HBBSc contendo 25 mg / ml DS para a tela, ou não DS para validação mutante (teste de saída). Todos os compostos a partir de Sigma-Aldrich.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate.">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein.">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii.">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li><li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion.">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li><li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells.">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li><li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells.">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li><li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca(2+)+release+from+inositol+1,4,5-triphosphate+(IP(3))/ryanodine-sensitive+stores.">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li><li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii.">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li><li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection.">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li><li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

<html> O protocolo descrito proporciona um método eficiente para isolar mutantes Toxoplasma com um defeito de saída. Conseguimos isolado mutantes ao longo vários passos da via de saída, alguns dos quais têm um fenótipo invasão dupla 13. Os potenciais efeitos na invasão pode ser determinada utilizando o chamado ensaio de vermelho-verde, o que diferencia invadido a partir de não-invadidas parasitas por coloração diferencial anticorpo 23,24. Para os ensaios de ambos os invasão e sa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 Banco M em DMSO, armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 Banco M em DMSO, armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Sulfato de Dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 mM de stock em PBS </td></tr><tr><td> Diff Rápido </td><td> Merck Química </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte do filtro </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 micrómetros filtro de policarbonato </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadoras de CO 2 </td><td> Vários fabricantes </td><td></td><td> CO, humidificada de 5% 2, em 35, 37 e 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Vários fabricantes </td><td></td><td> O ideal é invertido, campo de largura, com objetivo de óleo 63x ou 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (de acordo com Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml Solução Salina Balanceada Hanks (Hyclone número de catálogo SH30588) </li><li> 100 ul de 1M MgCl 2 (100 fim mM) </li><li> 100 ul de 1M CaCl 2 (100 fim mM) </li><li> 2,0 ml de 1M Hepes pH 7,3 (20 mM final) </li><li> 84 mg de NaHCO3 (10 mM final) </li></ul>

a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants

A generalizada, intracelular obrigatório, o protozoário parasita Toxoplasma gondii causa a doença oportunista em pacientes imunocomprometidos e causa defeitos congênitos em infecção congênita. O ciclo de replicação lítica é caracterizada por três fases: 1. invasão activa de uma célula hospedeira nucleada; 2. replicação no interior da célula hospedeira; 3. egresso activo a partir da célula hospedeira. O mecanismo de saída é cada vez mais apreciada como um processo único e altamente regulado, o que ainda é pouco compreendida no nível molecular. As vias de sinalização de saída subjacentes foram caracterizados através da utilização de agentes farmacológicos que actuam em diferentes aspectos das vias 1-5. Como tal, vários accionadores independentes de saída têm sido identificados, que convergem sobre a libertação de Ca 2 + intracelular, um sinal que é também crítico para a invasão da célula hospedeira 6-8. Esse insight informou uma abordagem de gene candidato, que levou à identificaçãoficação da planta como a proteína quinase dependente de cálcio (CDPK) envolvidos na saída 9. Além disso, vários avanços recentes na saída compreensão foram feitas usando (químico) abordagens genéticas 10-12. Para combinar a riqueza de informação farmacológica com o aumento da acessibilidade genética de Toxoplasma que recentemente estabeleceu uma tela que permite o enriquecimento de mutantes do parasita com um defeito na saída da célula hospedeira 13. Embora mutagénese química, utilizando N-etil-N-nitrosoureia (ENU) ou etilo metanossulfonato (EMS) tem sido utilizada há décadas no estudo da biologia Toxoplasma 11,14,15, só recentemente tem mapeamento genético de mutações subjacentes aos fenótipos se rotina 16 -18. Além disso, através da geração de mutantes sensíveis à temperatura, os processos essenciais podem ser dissecado e os genes subjacentes directamente identificado. Estes mutantes comportam-se como de tipo selvagem sob a temperatura permissiva (35 ° C), mas não conseguem proliferate à temperatura restritiva (40 ° C), como um resultado da mutação em questão. Aqui temos ilustrar um método de rastreio novo fenotípica para isolar mutantes com um fenótipo sensível à temperatura de saída 13. O desafio para as telas de ingresso é separar egressos dos não-egressos parasitas, o que é complicado pela rápida re-invasão e aderência geral dos parasitas nas células hospedeiras. Uma tela de saída foi anteriormente estabelecido com base numa série de passos complicados biotinilação para separar intracelular de parasitas extracelulares 11. Este método também não gerar mutantes condicionais, resultando em fenótipos fracos. O método descrito aqui supera a forte ligação de egressing parasitas através da inclusão de um concorrente glicano, sulfato de dextrano (DS), que impede a aderência de parasitas da célula hospedeira 19. Além disso, os parasitas extracelulares são especificamente morto por pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), o que deixa parasitas intracelularesileso 20. Portanto, com uma nova tela fenotípica especificamente para isolar mutantes parasitas com defeitos na saída induzido, o poder da genética agora pode ser totalmente implantado para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à saída da célula hospedeira.

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Encaminhar a genética é um método poderoso para desvendar a nível molecular de como<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egressos de sua célula hospedeira. Protocolos são fornecidos para mutagenizar quimicamente parasitas, enriquecer para os mutantes com defeitos na saída induzido, e validar o fenótipo de mutantes clonados.

A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

12.9K visualizações.  Boston College. Encaminhar a genética é um método poderoso para desvendar a nível molecular de como Toxoplasma Egressos de sua célula hospedeira. Protocolos são fornecidos para mutagenizar quimicamente parasitas, enriquecer para os mutantes com defeitos na saída induzido, e validar o fenótipo de mutantes clonados.

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Obtenção altamente purificada Toxoplasma gondii Oocistos por um gradiente de cloreto de césio descontínuos

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Imunologia e Infecção

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...