LPE é Senior Fellow escocês Clínica e reconhece o apoio do Escritório Cientista Chefe (SCD/03). Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust Projeto Grant para EFL (089.930). Narg foi financiado pelo Wellcome Trust um Programa Grant (080.088) e um Grant equipamento (075.470) (para DeltaVision), e por um Grant FP7-2007-2013 (SAÚDE-F2-2010-260338-ALLFUN). Gostaríamos de agradecer à Universidade de Aberdeen instalação de imagem, em particular, Kevin MacKenzie, de apoio e conselhos úteis.

1. C. albicans condições de crescimento e <ol><li> Preparar as placas de agar SC-Ura, adicionando 6,9 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, 1 ml de NaOH 1 M, 10 mL de 1% (w / v) de sal hemissulfato de adenina e 20 g de agar técnica (previamente descrito em detalhe em 11). Faça-se o volume para 900 ml com água destilada H 2 O. Autoclave, permita ágar arrefecer, mas não o suficiente para solidificar, e depois adicionar 50 ml estéril de 40% de D-glucose e 50 ml estéril a 4% SC-Ura dropout sob condições assépticas. Misturar, verte-se sobre placas de Petri e deixar placas de ágar arrefecer e solidificar. Loja de placas de agar a 5 ° C até à utilização. </li><li> Streak C. albicans serotipo A, estirpe CAI4 + CIp10 de estoques de glicerol armazenada a -80 ° C para SC-Ura placa de ágar. </li><li> Incubar a placa a 30 ° C até as colónias forma e armazenamento a 5 ° C. </li><li> Uma cultura única C. albicans colónia em 5 ml de meio SC-Ura (a receita como em 1.1, mas sem agar técnica) e incubar durante a noite a 30° C, 200 rpm, para gerar fase estacionária C. albicans. </li></ol> 2. C. albicans coloração com isotiocianato de fluoresceína (FITC) <ol><li> Adicionar 10 ul C. albicans cultura durante a noite a 990 ul de PBS (pH 7,4) e realizar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Para auxiliar a visualização de C. albicans durante ensaios de fagocitose, mancha 1 × 10 8 C. albicans, utilizando 1 mg / ml de FITC em 0,05 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio (pH 9,6) durante 10 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Para remover FITC desvinculado, lavar C. albicans em 1 ml 1 x PBS, centrifugação a 3000 × g durante 5 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de 1 x PBS. Repita 3 vezes. </li><li> Ressuspender o pellet em 1 x 10 6 células / ml em 1 x PBS. </li></ol> 3. Preparação da Linha Celular J774.1 Rato Macrophage <ol><li> Manter J774.1 macrófagos no tecido 75 cm 2frascos de cultura em meio DMEM suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina, a 37 ° C com 5% de CO 2. A preparação de macrófagos primários são descritos noutro documento em detalhe 12, 13. </li><li> Raspe J774.1 células do frasco de cultura de tecido e transferir para um tubo Falcon de 50 ml. Centrifugar a 600 xg durante 5 min para obter um pellet de células. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de pré-aquecida meio DMEM suplementado. Contar as células utilizando um hemocitómetro e placa 1 x 10 6 J774.1 macrófagos em 2 ml de meio DMEM suplementado em um prato de 35 milímetros de imagens à base de vidro. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Antes da imagiologia, substitua meio suplementado com 2 ml de DMEM pré-aquecido suplementado CO meio 2-independente (com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina) contendo 1 mM Lyso Tracker Red DND-99.</li></ol> 4. Vídeo ao vivo celular Ensaio Fagocitose Microscopia <ol><li> A escolha do microscópio dependerá do que estiver disponível localmente, mas a configuração microscópio terá de incluir uma fase invertida, uma câmara com ambiente aquecido a 37 ° C e de excitação / emissão de filtros para as manchas escolhidas (FITC e TRITC). </li><li> Ligar o aquecedor do microscópio antes da experiência e permitir tempo suficiente para a câmara de controlo do ambiente aquecer até 37 ° C. O tempo necessário para que a temperatura da câmara para estabilizar pode variar para diferentes configurações do microscópio. </li><li> Ligue o microscópio e computador, e carregar o software de imagem. Monte o prato de imagens no palco microscópio e ajustar o foco para encontrar os J774.1 macrófagos. Optimizar o aspecto das imagens TRITC e DIC, ajustando a percentagem de luz transmitida e tempos de exposição. </li><li> Retire o prato de imagem e adicionar 3 × 10 6 FITC manchado de C. albicans a tele prato. Anote o tempo que C. albicans é adicionada ao prato. Retorne o prato para o palco e otimizar a aparência das imagens FITC, se necessário. Configurar uma lista de pontos, se necessário. </li><li> Começar de imagem quando todos os pontos estão em foco e os canais são otimizados. Capturar imagens com FITC, TRITC e DIC a cada minuto durante 6 horas. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen,+Campylobacter+jejuni.">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , (2012).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation.">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar. NG é um receptor de subvenções de apoio irrestrito para a pesquisa básica pela Gilead Sciences. LE trabalha como consultor para a GSK no desenvolvimento de drogas mais cedo.

Aqui, o método para a utilização de células-vivo microscopia vídeo para estudar a fagocitose de macrófagos é descrito. Microscopia de vídeo oferece múltiplas camadas adicionais de informações para análise. Uma vantagem básica é que os dados de absorção pode ser gerada (a partir de uma única experiência) para qualquer ponto no tempo ao longo do período de observação de 6 horas. Mais importante, o método descrito permite a análise diferencial das fases individuais de fagocitose. Nós temos, por exemplo, mostra que as mudanças na absorção global da C. albicans glicosilação e mutantes morfogênese por linhas celulares de macrófagos e macrófagos primários pode ser uma consequência de mudanças na migração de macrófagos em relação às células-alvo ou de taxa de uma vez a imersão contacto célula-célula é estabelecida 7. Há uma série de armadilhas a evitar quando condução desses experimentos. Primeiro, é muito importante para garantir a estabilidade das condições ambientais durante o procedimento experimentalDure. Este é o melhor alcançado em uma câmara ambiental que está definida para as condições experimentais várias horas antes de iniciar o experimento. A qualidade do vídeo é altamente dependente de módulos sofisticados que usam lasers infravermelhos para manter automaticamente a amostra z posição independentemente das alterações mecânicas ou térmicas, eliminando assim a necessidade de correções de foco manual. Dada a natureza prolongada das experiências, é importante para limitar a exposição à luz do laser e efeitos associados fotobranqueamento e fotoconversão, que podem ser minimizados através da utilização de marcadores altamente fluorescentes, o que facilita baixos tempos de exposição. O protocolo de coloração FITC descrito aqui é rápida e fiável. Como FITC é um muito brilhante e estável de manchas, os tempos de exposição baixos são necessários e isso torna ideal FITC por longos time-lapse filmes. No entanto, habitualmente utilizam uma variedade de manchas alvo diferentes, incluindo calcofluor white e corantes PKH, bem como organismos marcados. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A maioria do nosso trabalho publicado é realizada utilizando um microscópio de campo amplo, mas a exposição pode ser ainda mais reduzido por meio de um microscópio confocal disco giratório e em nossas mãos é essencial para lapso de tempo microscopia de vídeo 3D. Durante este estudo, as imagens foram captadas a intervalos de 1 min ao longo de um ensaio de fagocitose 6 hr. O intervalo entre as imagens podem ser ajustadas de acordo com o processo sob investigação. Por exemplo, o intervalo pode ser diminuído quando se investiga processos rápidos como o tráfico vesicular. O intervalo de tempo mínimo será limitada pelas especificações de microscópio e camera. Há algumas considerações a ter em conta quando se ajusta horários. Primeiro, diminuindo o intervalo entre os instantâneos vai significar menos pontos podem ser visualizados e tamanho do arquivo será aumentado consideravelmente. Pelo contrário, o aumento do intervalo de imagem muito irá fazer o filme perde a continuidade. Esta abordagem pode ser aplicadaem princípio, para estudar outros patogénios e absorção de morte de células hospedeiras. Por exemplo, recentemente demonstrado que os macrófagos de medula óssea derivadas de camundongos deficientes sialoadhesin exibem muito reduzida de ligação e fagocitose de sialilado Campylobacter jejuni 8. No entanto, o tamanho do alvo é um importante determinante para a viabilidade, tal como a análise de imagens torna-se cada vez mais difícil com a redução do tamanho da célula-alvo. Software de análise sofisticada imagem é essencial para a análise rápida de vídeo microscopia, e isso deve ser acompanhado de suporte de bioinformática adequado para facilitar a geração de algoritmos para estudar a migração de células individuais e populações de células inteiras 7. Live-célula microscopia de vídeo em combinação com um sofisticado software de análise de imagem para a análise minuto-a-minuto da migração e individuais macrófagos C.albicans interações, fornece uma visão única sobre a complexidade da C. albicans fagocitose por macrophages. Há um enorme potencial para expandir estes métodos para estudar outros patogénios e fagócitos (células dendríticas, neutrófilos) e desenvolver a microscopia de vídeo 3D de imagem interacções célula-célula em maior detalhe ou em mais superfícies fisiológicos, tais como camadas de células epiteliais e endoteliais. Esta técnica é parte da próxima geração de ferramentas no estudo da interação patógeno-hospedeiro e vai ajudar a gerar informações detalhadas espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Base de levedura de nitrogênio sem aminoácidos </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Sal hemissulfato adenina </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar técnica (n. º 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura abandono </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Carbonato de sódio </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> Lyso Tracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 milímetros de vidro-pratos </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

Apuramento fagocítica de fungos patogénicos e microrganismos, de modo mais geral, podem ser considerados para consistir de quatro fases distintas: (i) a migração dos fagócitos para o local onde estão localizados os patógenos, (ii) reconhecimento do agente patogénico padrões moleculares associados (PAMPs) através do padrão receptores de reconhecimento (PRRs), (iii) imersão de microorganismos ligados à membrana celular dos fagócitos, e (iv) de processamento de células englobadas dentro de fagossomos vencimento e digestão da partícula ingerida. Estudos que avaliam a fagocitose na sua totalidade são informativas 1, 2, 3, 4, 5, mas são limitados na medida em que normalmente não se dividir o processo em imersão, migração e maturação do fagossoma, o que pode ser afectada diferencialmente. Além disso, estes estudos avaliar a absorção, como um evento único, e não como um processo dinâmico contínuo. Desenvolvemos recentemente tecnologias avançadas vivo de células de imagem, e combinaram estes com a análise funcional de ambos genéticacélulas de patógenos e de acolhimento para criar uma plataforma inter-disciplinar para a análise da função da célula imune inata e patogenicidade. Esses estudos têm revelado novos aspectos de fagocitose, que só poderia ser observados usando análise temporal sistemática das interações celulares e moleculares entre fagócitos humanos e fungos e microorganismos infecciosos em geral. Por exemplo, podemos ter começado a definir o seguinte: (a) os componentes da superfície da célula necessárias para cada fase do processo de imersão, o reconhecimento ea morte de células fúngicas 1, 6, 7, 8, (b) a geometria da superfície como influencia a eficiência de absorção de macrófagos e morte de células de levedura e hifa 7, e (c) como imersão leva a alterações do ciclo celular e no comportamento dos macrófagos 9, 10. Em contraste com a de um único ponto de tempo de instantâneos, live-célula microscopia de vídeo que permite uma grande variedade de células hospedeiras e organismos patogénicos para ser estudado como coseqüências ntinuous em períodos de tempo longos, fornecendo informação espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos, incluindo a migração celular, replicação e tráfico vesicular. Aqui descrevemos em detalhes como preparar hospedeiro e células fúngicas, e para realizar os experimentos de microscopia de vídeo. Estes métodos podem fornecer um guia para estudos futuros com outros fagócitos e microorganismos.

Aqui nós mostramos resultados representativos para C. albicans absorção por uma linha de células de macrófagos de murino J774.1 durante 6 horas uma experiência microscopia vivo de células de vídeo. Figura 1 é um representante vivo de células filme microscopia video, mostrando a fagocitose de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Live-célula microscopia de vídeo permite a internalização de C. albicans a ser visualizados sem a necessidade de se manchar Candida externa. No entanto, durante estas experiências, C. albicans foi corada usando o corante sensível ao pH com FITC (verde), o que é extinta durante a acidificação do fagossoma macrófago, e facilita a confirmação de que Candida foi internalizado (Figura 1). Para visualização auxílio adicional de C. ingerida albicans, macrófagos foram corados com o corante vermelho fluorescente Lyso Tracker red DND-99, os compartimentos que cora ácidos e serve como um marcador não específico de maturação do fagossoma.A Figura 2 é uma imagem fixa a partir de uma experiência de microscopia vivo de células de vídeo e ilustra a variação do número de C. albicans ingeridos por macrófagos J774.1 individuais. Nesta experiência, 82% de macrófagos J774.1 engolida pelo menos um C. albicans de células no final do ensaio de fagocitose 6 hr. Na Figura 3, o número de internalizada C. albicans células por macrófago é relatado. O número médio de C. albicans assumidas por macrófagos é de 3,4, mas curiosamente os macrófagos podem ingerir até 16 células fúngicas. Figura 4 é uma sequência de imagens estáticas de um representante experiência microscopia live-célula de vídeo mostrando um macrófago fagocitando C. albicans células, hifa de crescimento com o macrófago e lise de macrófagos. finalmente Figura 4 mostra que a microscopia de vídeo permite a análise de eventos após imersão de células-alvo, ou seja, dados podem ser gerados para o killing de macrófagos por C. albicans hifas em relação ao número e morfogénese de células alvo ingeridas, e como morte de macrófagos refere-se a maturação do fagossoma, que pode ser estudado em tempo real. Figura 1. Live-célula filme microscopia vídeo mostrando a fagocitose de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Os macrófagos são coradas utilizando o corante vermelho fluorescente Lyso Tracker red DND-99 e C. albicans são corados com FITC (verde). Macrófagos e C. albicans foram co-cultivados durante um período de 6 horas a 37 ° C em CO 2 completo independente meio. As imagens foram capturadas em intervalos de 1 min para 6 horas. Os macrófagos podem ser vistos estabelecer contacto célula-célula com C. albicans, que é então seguida pela absorção de C. albicans em fagossomas macrófagos. As setas indicam a C. albicans antes da imersão por macrófagos J774.1. Este vídeo mostra também que a fluorescência FITC é quenched imersão seguinte de C. albicans. Barra de escala, 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figura 2. Representante microscopia de vídeo ao vivo de células variação da imagem ainda mostra o número de C.albicans engolido por macrófagos individuais. Os macrófagos (coradas utilizando Lyso Tracker red DND-99) foram co-cultivados com FITC-stained C. albicans (verde). Há uma variação do número de C. albicans engolida (um número ao lado de uma seta indica o número de C. albicans engolida), e em C. albicans morfologia (ou seja, versos levedura hifa). Barra de escala, 20 m. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figura 3. Gráfico mostrando o número de C. albicans ingeridos por macrófagos murinos J774.1 no final de 6 ensaios de fagocitose hr. Os dados representam dois experimentos independentes. Um total de 100 macrófagos foram contados a partir de 3 campos de cada experiência, dando um total de 600 macrófagos individuais. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figura 4. Uma série de imagens a partir de um experimento representativo microscopia vivo de células vídeo mostrando um macrófago (M) e C. albicans (C), antes e durante o reconhecimento de (A, B), e, durante e após a absorção (C, D). C. albicans hifas continuar a crescer dentro do macrófago (E, F), o que pode resultar na lise de macrófagos (G). Outros macrófagos são recrutadas para o local de ruptura e tentam ingerir o C. libertado albicans (H). Os macrófagos são coradas utilizando o corante vermelho fluorescente LysoTracker vermelho DND-99 e C. albicans são corados com FITC (verde). Note-se que a coloração é parada após FITC C. albicans absorção por macrófagos J774.1 (C). Barra de escala, 10 um.

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Descrevemos métodos para live-célula vídeo de microscopia<em&gt; Candida albicans</em&gt; A fagocitose por macrófagos. Esses métodos permitem estágio específico de análise, migração de macrófagos, imersão, o reconhecimento e a maturação do fagossoma e revelar novos aspectos da fagocitose.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.8K visualizações.  University of Aberdeen. Descrevemos métodos para live-célula vídeo de microscopia Candida albicans A fagocitose por macrófagos. Esses métodos permitem estágio específico de análise, migração de macrófagos, imersão, o reconhecimento e a maturação do fagossoma e revelar novos aspectos da fagocitose.

Vídeo: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Imunologia e Infecção

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

De células vivas de Alphaherpes Vírus Transporte anterógrada e Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformação Biolistic de uma fluorescente Tagged Gene para o oportunista fúngica Pathogen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica