Mesmo que a edição de genes tenha se tornado popular para estudar a genética molecular de organismos não-modelo, a RNAi continua sendo uma poderosa ferramenta sinérgica. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada a diferentes estágios de desenvolvimento. Além disso, o knockdown parcial pode ser usado para estudar esses genes inteiros.
O sucesso do procedimento depende da injeção de DSR e de ter danos mínimos. Isso requer prática, então não desanime se for preciso algumas tentativas para acertar. Para preparar embriões em estágio inicial para micro injeção, primeiro despeje a ebulição de 20% em uma pequena placa de Petri e coloque três tubos plásticos de um a dois milímetros de largura na superfície do líquido que surgiu antes de se solidificar.
Uma vez que a agarose tenha solidificado use um par de fórceps contundentes para remover os tubos e cobrir as indentações resultantes com 500 microliters de água autoclave destilada. Quando o recipiente de coleta estiver pronto use uma escova de tinta de cabelo natural fina para transferir cinco embriões T.marmoratus de oito horas de idade dos locais de ninho de besouro em um prato de cavidade de vidro cheio de água autoclave destilada sob um microscópio estéreo. Usando o microscópio e as fórceps de dissecção fina agarram o acorde de cada embrião de ambos os lados e rasgam o acorde aberto permitindo que o embrião deslize suavemente para fora do tecido.
Depois de remover ambas as camadas de chorion de todos os embriões coletados use o pincel para transferir cuidadosamente os embriões do prato de cavidade de vidro para as ranhuras da placa de agarose preparada. Para injetar embriões em estágio inicial com RNA duplo estonteado específico do gene primeiro preparar agulhas de microinjeção em um puler agulha e usar o microscópio estéreo e encontrar fórceps para quebrar cada ponta a uma borda afiada. Depois de jogar o estoque purificado de duplo fio RNA de interesse no gelo, adicione um microliter de tampão de injeção de 10X à solução resultante e use água dupla destilada para trazer o volume de vinil da solução para 10 microliters.
Use uma pipeta P10 para enchir uma das agulhas de microinjeção preparadas com a solução de RNA dupla encalhada e carregar a agulha em um suporte de microagulha conectado a um sistema de microinjeção que utiliza a tecnologia de ejeção de pressão. Ligue o sistema de microinjeção e a fonte de ar pressurizada e use a micro válvula no sistema de microinjeção para ajustar a pressão de injeção a 15 quilos de pressão por polegada quadrada e, em seguida, use o botão de ajuste de tempo para definir a duração da injeção em segundos. Para calibrar a agulha de injeção avalie o volume da bolha de fluido que é formada na ponta da agulha ao injetar no ar para o embrião T.marmoratus use um tamanho de bolha ideal de 100 a 200 mícrons.
A agulha de injeção é de boa qualidade se bolhas ideais podem ser alcançadas a 15 quilos de pressão por polegada quadrada com uma duração de injeção de cerca de três segundos. Quando a agulha configurada estiver pronta, alinhe a agulha na placa de agarose de embriões de tal forma que a agulha se aproxime dos embriões em um ângulo de 45 a 60 graus. Use o micro manipulador para mover lentamente o microagulha até que a ponta toque a superfície do meio de um embrião e mova cuidadosamente a agulha para a frente até que ela apenas perfure a superfície do embrião.
Uma vez que a agulha esteja dentro do embrião pressione cuidadosamente o botão de injeção de micro injetor para entregar um a dois nanoliters de RNA duplo encalhado no embrião. Quando todo o RNA tiver sido entregue lentamente retraia a agulha do embrião sem causar a ruptura do embrião. Embriões injetados com sucesso podem ser identificados pela presença de um ponto colorido no local da injeção.
Quando todos os embriões tiverem sido injetados cuidadosamente coloque o prato em uma câmara de umidade em uma incubadora de 25 graus Celsius definida para um ciclo escuro de 14 horas de luz de 10 horas por quatro a cinco dias. Monitore o progresso do desenvolvimento de embriões diariamente sob o microscópio estéreo para identificar fenótipos de knockdown morfologicamente visíveis. Usando uma câmera digital de alta resolução para documentar o processo de desenvolvimento.
Remova quaisquer embriões mortos e reponha a água na placa de agarose diariamente para evitar a dessecação e a propagação da contaminação microbiana para outros embriões sobreviventes durante o período de incubação. Antes de coletar a larva adicione pela primeira vez 60 a 70 graus Celsius 2% líquido surgido a uma pequena placa de Petri. Quando a agarose solidificou o uso de fórceps contundentes para fazer um grupo raso por larva a ser injetado na agarose e drenar suavemente a água dos copos de cultura larva.
Após a anestesia, use fórceps macios para colocar cuidadosamente a larva na placa de imobilização com os pescoços e corpos nas ranhuras, mas a cauda localizada acima da superfície da ágarose. Quando toda a larva foi colocada, cubra cada lava com uma espessa camada de agarose que ainda é líquida, mas não perigosamente quente e livre quaisquer contos que foram acidentalmente cobertos conforme necessário. para uma microinjeção de RNA duplamente encalhada carregar um microativo com a solução de trabalho de RNA dupla encalhada específica do gene, como demonstrado.
Redescalgue o êmbolo de uma seringa de microinjeção controlada manualmente e carregue a agulha no sistema de microinjeção. Posicione a larva imobilizada sob o microscópio estéreo de modo que o local da injeção esteja alinhado com a trajetória da agulha de microinjeção em um ângulo relativamente plano. Use o micro manipulador para mover cuidadosamente a ponta da agulha para dentro da larva e aplicar lentamente e cuidadosamente pressão na seringa, ajustando a pressão de injeção de acordo com o movimento do fluido de injeção colorido na agulha, conforme necessário.
Quando todo o RNA tiver sido injetado use fórceps macios para libertar a larva da agarose e colocar a larva em um novo recipiente de água de temperatura ambiente a 25 a 28 graus Celsius e um ciclo escuro de 14 horas de luz de 10 horas. Nesta análise representativa, três genes diferentes foram derrubados em uma variedade de diferentes estágios de desenvolvimento do besouro de mergulho de explosão solar T.marmoratus. A interferência de RNA é realizada como demonstrado pela injeção de RNA de dupla-encalhada em um estágio muito inicial de embriogênese.
Alguns dos embriões não sobrevivem ao processo e se tornam necroses. Nessas imagens, eles controlam o indivíduo e um indivíduo com uma cor um pouco mais clara dos olhos pode ser observado. Neste indivíduo, um knockdown mais severo em que as mentiras mais ventral do aglomerado são completamente despigmentados, mas os aliados do ainda mostram alguma pigmentação pode ser observada.
Aqui um exemplo de outro indivíduo com essencialmente perda completa de pigmento em todos os olhos é mostrado. Lac2 derrubado em larvas resulta em uma cutícula menos pigmentada, indivíduos adultos mais leves com asas um pouco deformadas provavelmente devido à maciez incomum do tecido também foram obtidos. Certifique-se de olhar atentamente para observar seus animais injetados diariamente e remover imediatamente quaisquer indivíduos mortos.
O poder desta técnica é que ela pode ser aplicada aos genes de muitos organismos diferentes. Esta técnica também foi amplamente e bem aplicada à biologia do desenvolvimento evolutivo.
