Este é um protocolo de vídeo para o método de interferência de RNA mediado por eletroporação em Odonata. Libélulas e damselflies, membros da ordem Odonata, estão entre os insetos mais ancestrais. Odonata adulto mostra uma diversidade notável nas cores e padrões corporais, e muitos estudos ecológicos e comportamentais têm sido realizados.
No entanto, faltam estudos genéticos moleculares sobre Odonata, porque a análise funcional genética é muito difícil. Por exemplo, o método RNAi convencional não é eficaz na espécie Odonata. Recentemente, estabelecemos um método RNM em combinação com eletroporação in vivo.
Aqui, fornecemos um protocolo de vídeo para o RNAi mediado por eletroporação em libélulas e damselflies. Como nossa espécie representativa damselflies usamos a damselfly de cauda azul. Ischnura Senegalensis.
Esta é uma das espécies mais comuns e frequentemente encontradas em lagos ensolarados no Japão. Primeiro, mostramos o protocolo RNAi visando o abdômen de uma damselfly, Ischnura senegalensis. Depois da anestesia gelada em que dois pinos em ambos os lados do protórax e fixar a larva em um suporte fixo.
Puxe e estique a membrana intersu segmentar entre o sétimo e oitavo segmento abdominal usando fórceps. Mantenha a membrana inter-segmental esticada à mão. Insira a ponta do capilar preparado na membrana intersegmental esticada.
Injete 1 microliter de solução siRNA ou dsRNA. Aplique duas gotículas de gel de ultrassom na superfície larval usando fórceps. Coloque eletrodos no gel de ultrassom, com o eletrodo positivo na lateral da injeção.
Gerar pulsos de eletroporação 10 vezes usando um eletroporador. Limpe o gel restante na superfície com uma toalha de papel. Remova os pinos de insetos e mantenha as larvas tratadas em uma toalha de papel molhada por aproximadamente um dia para recuperação.
Em seguida, mostramos o protocolo RNAi visando o tórax de uma damselfly, Ischnura senegalensis. Após anestesia gelada, conecte dois pinos em ambos os lados do protórax e fixe a larva em um suporte fixo. Puxe e estique a membrana intersegmental entre o protórax e o synthorax usando a mão.
Insira a ponta do capilar preparado na membrana intersegmental esticada. Injete um microliter de solução siRNA ou dsRNA. Aplique duas gotículas de gel de ultrassom na superfície da larva usando fórceps.
Coloque eletrodos no gel de ultrassom, com um eletrodo positivo na lateral da injeção. Gerar pulsos de eletroporação 10 vezes usando um eletroprolator. Limpe o gel restante na superfície com uma toalha de papel.
Remova os pinos de insetos e mantenha as larvas tratadas em uma toalha de papel molhada por aproximadamente um dia para recuperação. Como uma espécie representativa de libélulas, usamos a libélula de skimmer Pied. Pseudothemis zonata.
Esta é uma das espécies de libélulas mais comuns e frequentemente encontrada em lagos sombrios no Japão. Finalmente, mostramos o protocolo RNI visando o abdômen de uma libélula, Pseudothemis zonata. Estique a membrana intersegmental entre o quarto e o quinto segmento abdominal.
Faça um pequeno buraco com uma agulha fina entre o quarto e o quinto segmento abdominal. Insira a ponta do capilar preparado no orifício preparado. Injete um microliter de solução siRNA ou dsRNA.
Fixar a larva em um suporte fixo usando pinos. Aplique duas gotículas de gel de ultrassom na superfície larval usando fórceps. Coloque eletrodos no gel de ultrassom com o eletrodo positivo na lateral da injeção.
Gerar pulsos de eletroporação 10 vezes usando um eletroporador. Limpe o gel restante na superfície com uma toalha de papel. Remova os pinos de insetos e mantenha as larvas tratadas em uma toalha de papel molhada por aproximadamente um dia para recuperação.
Aqui selecionamos um gene de síntese de melanina MCO2 como o gene alvo, e EGFP ou bla como um alvo de controle negativo. MCO2 é essencial para a formação de cores negras em vários insetos. Primeiro mostramos os resultados no abdômen de Ischnura Senegalensis.
Pontas de flechas brancas indicam as regiões de pigmentação negra suprimida onde o eletrodo positivo foi colocado após eletroporação. A incubação da pigmentação foi observada tanto pelo tratamento do siRNA quanto pelo tratamento do dsRNA. O tamanho e a localização do fenótipo RNI variaram consideravelmente entre os indivíduos.
Sem eletroporação não foram observados fenótipos de RNI, indicando que a eletroporação é essencial para o RNI nesta espécie. Em seguida, mostramos os resultados no tórax de Ischnura senegalensis. Da mesma forma, observou-se inibição da pigmentação negra em torno da região onde o eletrodo positivo foi colocado após a eletroporação.
Finalmente, mostramos os resultados no abdômen de Pseudothemis zonata. Como esperado, o fenótipo RNI foi detectado ao redor da região onde o eletrodo positivo foi colocado após eletroporação. Confirmamos que o método RNAi mediado por eletroproration é muito útil em Odonata.
Pode induzir a supressão genética local quase 100% de eficiência. Pelo menos em epiderme, quando selecionamos estágios de desenvolvimento apropriados. Este método tem vários sobre o método CRISPR/Cas9.
Por exemplo, a região onde os fenótipos RNAi aparecem pode ser controlada pela posição do eletrodo positivo após a eletrização, e os fenótipos de RNA podem ser facilmente comparados com os fenótipos de controle lado a lado no mesmo indivíduo. Além disso, este método não requer microinjeção em ovos minúsculos. Por isso, é muito mais fácil e rápido observar o fenótipo mais rápido do que o método CRISPR/Cas9.
Além disso, este método pode ser aplicado a insetos cujos ovos recém-colocados são difíceis de coletar. Por exemplo, fêmeas de Pseudothemis zonata colocam ovos durante o voo. Por isso, é muito difícil coletar seus ovos recém-colocados.
Esperamos que este protocolo possa ser geralmente aplicável a organismos não-modelo quando o RNI convencional não funciona de forma eficiente.
