Os autores gostariam de agradecer o apoio da &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; para criação de animais. Este trabalho foi financiado por fundos da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) para Michael Schubert, pela concessão União Europeia FP6 &quot;Embryomics&quot; e pela concessão ANR &quot;ANR- 10 BLAN-121801 Dev-Process &quot;para Jean-François Nicolas e Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho é financiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (SFRH / BD / 86878/2012). Os pedidos de vectores descritos aqui podem ser enviadas diretamente para os autores.

1. Preparação de aparelhos e reagentes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Transferir pipetas Pasteur <ol><li> Gerar uma série de pipetas de transferência Pasteur com diferentes diâmetros de ponta, puxando 230 milímetros de comprimento pipetas Pasteur acima de uma chama em velocidades diferentes. Certifique-se de que a vela é o maior tempo possível para um controlo suave e multa de aspiração. </li><li> Com um estilete de diamante, arranhar a pipeta ao longo de uma linha perpendicular ao comprimento da pipeta. Com as duas mãos, puxe a pipeta paralelo ao seu comprimento para gerar um corte contuso. Rapidamente chama-polonês a pipeta sem lacrar a ponta. </li><li> Variar o diâmetro da ponta com a fase dos oócitos / embriões de ser pipetado: 300-400 mm para oócitos não fertilizados (cerca de 150 um de diâmetro), 600 um, para os ovos fertilizados (cerca de 500 um de diâmetro), de 200-400 pm para neurulae chocado. Usar pipetas com um tubo de aspiração monitorado-boca para transferir oócitos / embriões a partir de um pratopara outro. </li></ol></li><li> As agulhas de injecção <ol><li> Manipular os capilares com luvas de assegurar condições livre de RNase. Use o vidro de borosilicato com capilares de filamentos com dimensões de OD 1,20 milímetros, 0,94 milímetros ID, comprimento 10 mm. </li><li> Se capilares são puxados sobre o tipo de aquecimento-filamento agulha extrator descritas na Lista de Materiais, use as seguintes configurações: Calor 600, Pull 50, Velocity 80, Tempo 60, 200 ou 300. Pressão Caso contrário, certifique-se de que a forma, o que é crucial para injecções bem sucedidas, como é mostrado na Figura 2, com as seguintes propriedades: 4-8 um de diâmetro de ponta exterior de 2 cm de comprimento do afunilamento. NOTA: As agulhas podem ser puxado antes da época de desova e utilizado durante toda a temporada. </li></ol></li><li> Vermelho de Fenol solução estoque de 5% (4x) <ol><li> Prepare fresco antes de cada época de desova. </li><li> Em um tubo de micrometros de filtração de 0,22, pesar 25 mg de Fenol em pó vermelho. </li><li> Adicionar 0,5 ml de DNase e RNase água parao tubo contendo o pó. </li><li> Girar durante 3-5 min a 18,000 xg à temperatura ambiente para filtrar-esterilizar a solução e remover os cristais que poderiam obstruir a agulha da injecção. </li><li> Armazenar a 4 ° C ou armazenar 250 mL alíquotas a -20 ° C. </li></ol></li><li> 0,25 mg de solução de poli-lisina / ml <ol><li> Prepare fresco antes de cada época de desova. </li><li> Dissolve-se 5 mg de poli-L-lisina em 20 ml de água destilada. Loja 5 ml de partes alíquotas a -20 ° C. </li><li> Usar uma alíquota descongelada imediatamente e apenas uma vez para assegurar a aderência reprodutível e robusto dos oócitos para o prato de poli-lisina-revestidas. </li></ol></li><li> síntese de ARNm <ol><li> Prepare fresco antes de cada época de desova. </li><li> Linearizar 5 ug de ADN de interesse com a enzima adequada (normalmente durante 2 horas, a 37 ° C). Para verificar a integridade da digestão, execute 2% em volume da mistura de digestão em um 1% agarose-TBE gel em tampão TBE a 150 W por 20 min. </li><li> Extraia o lineaADN zado com 25: 24: 1 de fenol (pH 8,0): clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase (superior) aquoso. </li><li> Extrai-se a fase aquosa novamente com 24: 1 de clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa. </li><li> Precipitar o DNA linearizado com 100: 10: 300 DNA linearizado: 3 M de acetato de sódio (pH 5,2): 100% de etanol durante a noite a -20 ° C. </li><li> Centrifugar 20 min a 18000 xg, a 4 ° C. Enxágüe em etanol 70%. </li><li> Centrifugar 10 min a 18000 xg, a 4 ° C. Deixar secar e ressuspender em água isenta de ARNase para uma concentração final de 0,5 ug / uL. </li><li> Transcrever 1 ug de ADN linearizado utilizando um kit de síntese de ARNm com a polimerase apropriada, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Extrai-se o ARNm com 5: 1 de fenol (pH 4,7): solução de paragem clorofórmio e acetato de amónio fornecido com o kit. </li><li> Vortex durante 20 segundos, centrifuge 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa. </li><li> Extrai-se a fase aquosa novamente com 24: 1 de clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa. </li><li> Precipitar o ARNm com isopropanol a 100% durante a noite a -20 ° C. </li><li> Centrifugar 20 min a 18000 xg, a 4 ° C. Enxágüe em etanol 80%. </li><li> Centrifugar 10 min a 18000 xg, a 4 ° C. Deixar secar o sedimento à temperatura ambiente durante não mais do que 5-10 minutos, uma vez que será então difícil de re-suspender. Ressuspender em água DNase e RNase para uma concentração final de pelo menos 2 ug / uL de assegurar uma concentração final de ARNm decente na mistura de injecção. </li><li> Para verificar a qualidade e tamanho do produto de transcrição, 0,5 ul de executar o ARNm sobre um 1% de agarose-TBE-gel de RNase livre em tampão TBE a 150 W durante 20 minutos. Loja 2 mL alíquotas a -80 ° C. </li></ol></li><li> Pratos revestidos com poli-lisina- NOTA: Poli-lisina coated pratos são usadas para imobilizar os oócitos durante a injecção. <ol><li> Para cada 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri (5 no total), cobrir o fundo da placa de Petri com 1 ml da solução de poli-lisina descongeladas 0,25 mg / ml. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Para cada 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri (5 no total), transferir a solução de poli-lisina a 0,25 mg / ml em mais 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Descartar a solução de poli-lisina a 0,25 mg / ml. </li><li> Deixe as placas de Petri seco, de cabeça para baixo, à temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Armazenar as placas revestidas de poli-lisina-embrulhados num invólucro de plástico a 4 ° C para evitar a contaminação de uma semana no máximo. </li></ol></li><li> Pratos revestidos-Agarose NOTA: Eles são usados ​​para cultura de embriões injetado. A agarose proporciona uma almofada para os embriões injectados e evita que fiquem coladas ao fundo do prato. <ol><li> Faça a água do mar artificial (ASW) usando 37-38 g / L commsais ercial + 0,25 mM NaHCO3 em água de osmose reversa. </li><li> Dissolve-se uma concentração de agarose a 1% em 0,22 mm ASW-filtrada por aquecimento da solução em um forno de microondas. </li><li> Verter rapidamente a solução de agarose quente a partir de uma placa de Petri de 35 milímetros para um outro, a fim de assegurar um revestimento de agarose muito fina do prato. </li><li> Armazenar as placas revestidas com agarose embrulhados em Saran a 4 ° C para evitar a contaminação de uma semana no máximo. </li></ol></li><li> Mistura injecção e carregamento das agulhas de injecção <ol><li> Cerca de 2 horas antes de iniciar as injecções, faça uma mistura de 2 ul de injecção em RNase e DNase-livre de água com concentrações finais de 1-1,8 mg / mL de ARNm, 15% de glicerol, 1,25% de vermelho de fenol. NOTA: As cores de vermelho de fenol, a solução, que permite a monitorização do rendimento de injecção e a identificação dos embriões injectados com sucesso. Glicerol favorece a difusão de ARNm dentro do oócito. </li><li> Centrifugar 4 min a 18000 xg paracristais de pelotização. Manter em gelo até o uso. </li><li> Com uma pipeta de 10 uL, recolher 0,5 ul da mistura de injecção, evitando a parte inferior do tubo, onde os cristais foram sedimentadas. </li><li> Backfill, pelo menos, duas agulhas de injecção (no caso de uma pausas durante a injeção) pipetando a queda de 0,5 ul de mix injecção na grande abertura da agulha. </li><li> Instalar as agulhas em um frasco de armazenamento com o líquido na parte inferior a 4 ° C para evitar a evaporação da mistura de injecção. Deixe a mistura lentamente injecção viajar para a ponta da agulha de injecção durante pelo menos 1 hora a minimizar a criação de bolhas. </li><li> Loja mistura injecção adicional a -80 ° C para um máximo de três utilizações adicionais, após o que deteriora a qualidade do mRNA (dados não mostrados). </li></ol></li></ol> 2. coleta de material biológico, Microinjection e cultura de embriões <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ovócito e espermatozóide coleção NOTA: Ver Theodosiouet al. 12 para um protocolo detalhado para induzir a desova e para a coleta de gametas. <ol><li> Machos e fêmeas de choque em ASW a 23 ° C durante 24 horas. </li><li> Uma a duas horas antes do pôr do sol, transferir os adultos em copos individuais em ASW a 19 ° C, porque a maioria dos adultos vai gerar 1-2 horas após o por do sol. </li><li> Enxágüe 35 milímetros placas de Petri em ASW filtrada e deixe-os secar de cabeça para baixo para evitar que os oócitos de degola para o fundo do prato. </li><li> Após a desova, recolher imediatamente espermatozóides e ovócitos com uma pipeta de 1000 mL. <ol><li> Manter espermatozóides e oócitos separar amphioxus adulto porque o contacto é prejudicial para a saúde de gâmetas (dados não mostrados). </li><li> Além disso, evitar surpreendente os adultos, que leva a movimentos que dissipam, e, portanto, diluir, tanto de esperma e de oócitos. Para manter o esperma ativo o maior tempo possível e para otimizar a taxa de fertilização, coletar o esperma tão concentrado quanto possível. </li></ol></li><li> Manteresperma em gelo em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Oócitos Transfer in filtrada ASW para as pré-lavadas 35 milímetros placas de Petri. </li><li> Transferência 100-500 ovócitos com uma previamente puxado 300-400 mm transferência Pasteur pipeta para outra 35 milímetros placa de Petri para realizar as injeções. </li><li> Fertilizar o restante da embraiagem como um controlo para a qualidade dos oócitos e esperma ou para outras experiências. </li></ol></li><li> Injeção de ovócitos <ol><li> Instalar a agulha de injecção no micromanipulador a uma 50 ° ângulo em relação ao plano horizontal. NOTA: Angles de menos de 50 ° vai empurrar os oócitos em torno do prato, enquanto ângulos de mais de 50 ° não permitirá um adequado acompanhamento da posição da agulha em relação ao oócito. </li><li> De acordo com um escopo de dissecação fluorescente com 25X oculares, transferir 30 oócitos com a transferência de uma pipeta de Pasteur de 300-400 mm numa placa revestida com poli-lisina-ASW contendo filtrada. </li><li> Deposite os ovócitos ao longo de uma linha de transportarinjecções de fora de uma maneira ordenada e para distinguir injetados a partir de oócitos não injetados. Injectar pequenas quantidades (30 oócitos) para minimizar o tempo de exposição dos oócitos para a poli-lisina, a qual tende a deformar-se os embriões em desenvolvimento (dados não apresentados). </li><li> Use a iluminação de campo escuro para tornar os ovócitos como translúcido possível. </li><li> Com o botão de movimento grosseiro do micromanipulator, trazer a agulha de injeção perto de um ovócito. </li><li> Com uma pinça fina, corte abrir a agulha no nível onde a ponta começa a ser curvada. Pulsando com o injector, verifique se mistura injeção vermelho é, na verdade, que flui para fora da agulha. </li><li> Com uma ampliação de 200X e com o botão de movimento fino do micromanipulador, mover-se suavemente a agulha de injecção no interior do núcleo do oócito. NOTA: Se inserido muito superficialmente, a solução injetada não permanecerá no interior do oócito. Se inserido muito longe, o oócito será destruído. </li><li> Injectar com 1-3 pulsos de 120 mseg Duracião e 1-10 psi de pressão. Se a agulha é suficientemente fina, injectar com fluxo contínuo a pressão constante. Certifique-se de que o volume de injecção corresponde a 1/5 a 1/3 do volume de um único oócito. </li><li> Após a injecção, retire a agulha rapidamente para evitar a fuga do oócito. </li><li> Verificar que a solução injectada permaneça no oócito e que, após alguns segundos, a solução injectada se espalha em todo o oócito. </li><li> Mover para a próxima oócito na linha. </li><li> Mantenha alguns embriões uninjected de cada série como controle negativo para estimar a fluorescência de fundo durante uma verificação de embriões injetados. </li></ol></li><li> Fertilização, a seleção de embriões injetados e cultura de embriões <ol><li> Fertilizar os oócitos assim que uma série ter sido injectado. Como a qualidade do ovócito diminui com o tempo, injetar e fertilizar óvulos dentro de 1 hora após a desova 12. </li><li> Dependendo da concentração espermática, adicione 1-5 gotas de esperma para os oócitos eagite o prato. NOTA: O envelope fertilização deve tornar-se evidente nos embriões após cerca de 1 min. </li><li> Permitir que os embriões para separar a partir do prato de poli-revestido-lisina, durante a injecção outra série de oócitos. </li><li> Transferir os embriões com a 600um transferência pipeta de Pasteur a uma placa de Petri revestidas com agarose. Remover os embriões a partir do prato revestido com poli-lisina-o mais rapidamente possível, se possível, antes da fase de 2 células. NOTA: Em caso de exposição prolongada a poli-lisina, os embriões tendem a tornar-se blástulas densamente agrupadas, achatado no lado tocar no fundo do prato. </li><li> Na fase 2-célula para 4 células, selecione com um escopo de dissecação fluorescente com filtro DSR os embriões com sucesso-injetados, ou seja, aqueles com uma morfologia normal que exibem um sinal fluorescente vermelha Vermelho de Fenol-derivadas. </li><li> Manter os embriões em cultura em filtrada ASW em placas de Petri revestidas com agarose a 19 ° C até à fase desejada deimagem in vivo. </li></ol></li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Neste artigo, apresenta-se, pela primeira vez, um protocolo detalhado e reprodutível para a injecção de B. oócitos lanceolatum, que, depois de B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, é, assim, a terceira espécie anfioxo, para que uma tal técnica tem sido descritas. É importante notar que o protocolo aqui descrito também inclui a descrição de sistemas de vectores adequados para a produção de proteínas fluorescentes em B. lanceolatum injectados a...

Durante o desenvolvimento, uma única célula dá origem a um organismo inteiro num processo altamente complexo que envolve ambos os movimentos e divisões celulares. Para melhor compreender os princípios biológicos subjacentes a dinâmica do comportamento celular, os biólogos do desenvolvimento começaram a usar em técnicas de imagem vivo à base de fluorescência. Compartimentos específicos de células, como as membranas celulares, ou podem ser marcados por meio de tratamentos com corantes fluorescentes, uma abordagem dificultada por uma falta de especificidade e de penetração no tecido 1, ou pela introdução específica para o embrião de mRNAs exógenos que codificam proteínas fluorescentes 2. Técnicas diferentes podem ser usadas para a entrega eficiente de substâncias exógenas, tais como ARNm. Estes incluem, mas não se limitam a, microinjecção, electroporação, bombardeamento com micropartículas, lipofecção e transdução de 3,4. Apesar de todas estas abordagens podem ser utilizadas para introduzir compostos exógeno numadesenvolvimento do embrião, só microinjeção permite a aplicação de quantidades pré-definidas e precisas em cada célula 3. Técnicas de microinjeção foram descritas para todos os principais sistemas modelo de desenvolvimento 4 (por exemplo, moscas de frutas, vermes nematóides, peixe-zebra, sapos, ratos), bem como para alguns modelos alternativos 4, incluindo aqueles usados ​​para estudos comparativos que visam a compreensão da evolução dos mecanismos de desenvolvimento (por exemplo, anêmonas do mar, vermes anelídeos, ouriços do mar, tunicados de ascídias, o anfioxo cephalochordate). Cephalochordates que, juntamente com tunicados e vertebrados estabelecer o filo dos cordados, particularmente modelos bem adequado para estudar a evolução de cordados e da diversificação de vertebrados de um ancestral invertebrado 5-8. A linhagem cephalochordate divergiram muito cedo durante a evolução cordados; e cephalochordates existentes, que são subdivididas em três gêneros (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), se assemelham vertebrados tanto em termos de anatomia geral e arquitetura do genoma 5-8. Dos cerca de 30 espécies de cephalochordates que foram descritas até agora, cinco estão disponíveis para estudos de embriologia e desenvolvimento: 6,9 Asymmetron lucayanum (o lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (o anfioxo Florida), Branchiostoma lanceolatum (o anfioxo Europeia), Branchiostoma belcheri (o anfioxo chinês) e Branchiostoma japonicum (o anfioxo japonês). Adultos maduros de três destas espécies (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) podem ser induzidas a desovar sob demanda durante a época de reprodução 10,11. Além disso, pelo menos para B. lanceolatum, desova eficiente pode também ser induzida em água do mar artificial 12, tornando esta espécie cephalochordate particulares acessível para laborators que não têm acesso à água do mar natural. A combinação, em B. lanceolatum, de um acesso conveniente e confiável para embriões com um método de entrega eficiente, como a microinjeção, até agora a única técnica de entrega desenvolvido em anfioxo (em ambos B. floridae e B. belcheri) 13-15, permitirá o desenvolvimento de um novela conjunto de técnicas de manipulação, incluindo tracing- linhagem e abordagens baseadas em comportamento de células dinâmica. Um protocolo para a microinjecção eficiente de ARNm para expressar as proteínas fluorescentes na B. lanceolatum embrião foi, portanto desenvolvido. Além disso, para fornecer um conjunto de ferramentas de base para geração de imagens ao vivo de B. embriões lanceolatum, foram desenvolvidos sistemas de vectores que permitem a associada à membrana e expressão nuclear de proteínas fluorescentes. Para segmentação membrana, maior proteína verde fluorescente (eGFP) foi fundido com a caixa CAAX humano HRAS e localização nuclear de mCherry e eGFP foiobtido por fusão para o peixe-zebra exão histona 2B (H2B) (Figura 1, complementar do ficheiro 1). Além disso, com o objectivo de optimizar a tradução da proteína, as sequências Kozak e codões das construções tenham sido modificados e adaptados para uso em B. lanceolatum. Tomados em conjunto, o método de injecção e vectores de expressão aqui apresentados servem como uma base para a geração de novas abordagens experimentais para cephalochordates, nomeadamente as análises usando o mais recente de fluorescência com base em técnicas de imagiologia in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

O protocolo detalhado acima fornece a base para a microinjecção de B. oócitos lanceolatum e, consequentemente, para a introdução em desenvolvimento B. Lanceolatum embriões de ARNm que codificam as proteínas fluorescentes para imagiologia in vivo. Embora a técnica é robusta e fiável, certamente, a taxa de injecções de sucesso utilizando este protocolo continua a ser variável (Tabela 1). A explicação muito provável para este facto é intrigante a extrema...

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.

Expressão de proteínas fluorescentes em<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K visualizações.  Institut Pasteur.  Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes. 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Biologia do Desenvolvimento

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separação de células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...